槲皮素配合物的制備及其抑菌作用的研究

黃酮類化合物（qu）是許多植物中常見的活性成分之一。槲皮素具有較好的祛痰、止咳作用,并有一定的平喘作用,還有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量等作用。近年研究表明,槲皮素在癌癥防治上也具有重要作用。槲皮素分子的特殊結(jié)構(gòu)中,強(qiáng)配位氧原子與合適的空間構(gòu)型可與多種金屬離子生成配位數(shù)不同的配合物,將這種具有特定生理活性的槲皮素與金屬離子形成配合物,既增強(qiáng)了配體的生物活性,又降低了其毒性。研究表明,有些槲皮素過渡金屬配合物具有明顯的生物活性,有些藥理作用顯著,有些已證明具有抗菌性和抗腫瘤活性。因此,槲皮素的改性產(chǎn)物成為國內(nèi)外近些年來研究的熱點(diǎn),但對(duì)第一過渡系金屬槲皮素配合物的抑菌活性報(bào)道很少,有少數(shù)報(bào)道的是在不同的條件下研究的個(gè)別改性產(chǎn)物,無系統(tǒng)性研究,且研究的結(jié)果也有較大差別。該課題組前期對(duì)槲皮素與第一過渡系生命元素形成的配合物在同等條件下的抗氧化作用進(jìn)行了比較研究,目前,國內(nèi)外對(duì)槲皮素與第一過渡系生命元素形成的配合物在同等條件下的抗菌活性的比較研究鮮有報(bào)道。該課題系統(tǒng)比較研究了第一過渡系生命元素對(duì)槲皮素改性產(chǎn)物配合物的抑菌活性,對(duì)開拓槲皮素改性配合物在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有實(shí)際意義。1材料和方法1.1試劑:四羥甲基氨基甲烷槲皮素,氯化鈉,乙酸鉻,乙酸錳,乙酸鐵,乙酸鈷,乙酸鎳,乙酸銅,乙酸鋅,無水乙醇,甲醇,二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO),三羥甲基氨基甲烷(Tris),均屬分析純,以上試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。牛肉膏,蛋白胨,瓊脂均屬生化試劑:上海匯合生物科技有限公司。供試菌種:大腸桿菌(Eschelichiacoli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusus)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草桿菌(Bacillussubtilis):由江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。1.2儀器、試器和儀器BSC-1300IIB2無菌工作臺(tái):蘇凈集團(tuán)安泰公司制造;250B數(shù)顯生化培養(yǎng)箱:常州國華電器有限公司;YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV2401紫外可見分光光度計(jì):日本島津公司;721分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF110型電子分析天平:中國輕工業(yè)機(jī)械總公司常孰衡器公司;RE-S2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;Tensor27紅外光譜儀:德國Bruker公司;JJ-1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器:江蘇金壇中大儀器廠;202-3電熱恒溫干燥箱:上海申光儀器儀表有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1金屬離子與引起物的合成在探討出來的最佳合成條件(溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間)下制備第一過渡系生命元素的槲皮素配合物。稱取一定量的槲皮素,溶于一定量體積的無水乙醇中,電磁攪拌;待大部分配體溶解后,用乙酸鈉溶液或HAc-NaAc緩沖體系調(diào)節(jié)溶液至合適的pH值;邊攪拌邊加入溶有一定量的過渡金屬醋酸鹽的無水乙醇溶液,并在一定溫度條件下攪拌一定時(shí)間,溶液中有沉淀生成,停止反應(yīng),離心分離,用無水乙醇和蒸餾水洗滌沉淀,于60℃真空干燥得到有色固體樣品,經(jīng)結(jié)構(gòu)表征得到(1)Qu-Cr;(2)Qu-Mn;(3)Qu-Fe;(4)Qu-Co;(5)Qu-Ni;(6)Qu-Cu;(7)Qu-Zn等改性配合物,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了紫外、紅外、熱分析表征及理化性質(zhì)測(cè)定,表明金屬離子與槲皮素(Qu)以配位鍵結(jié)合形成了配合物。按實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)所需溶液的濃度要求稱取一定質(zhì)量溶于合適的溶劑配制好溶液待用。1.3.2第一過渡系生命元素對(duì)山羊化學(xué)產(chǎn)物的抑制作用(1)不同ph值的瓊脂質(zhì)培養(yǎng)液和培養(yǎng)液對(duì)其菌種的控制稱取5.0gNaCl、10.0g蛋白胨、3.0g牛肉膏于1000mL的燒杯中,加入800mL的蒸餾水,加熱攪拌使其溶解,待充分溶解后,加入15g瓊脂粉,加入200mL的蒸餾水,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5,煮沸2次后,趁熱轉(zhuǎn)移至洗凈的培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)皿中也挺冷卻凝固后,將培養(yǎng)皿置于壓力蒸汽滅菌器中滅菌20min。滅菌完畢后,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),若無菌生長,即可放入冰箱待用。(2)濃度對(duì)材料抑菌作用的影響以DMSO為溶劑溶解一定量的配合物,將樣品編號(hào)為(1)Qu-Cr;(2)Qu-Mn;(3)Qu-Fe;(4)Qu-Co;(5)Qu-Ni;(6)Qu-Cu;(7)Qu-Zn;(8)Qu;(9)Cu(Ac)2;(10)R(Ac)3(R=Cr,Fe);(11)Y(Ac)2(Y=Mn,Co,Ni,Zn)用無菌水稀釋成10mg/mL質(zhì)量濃度的溶液,采用同樣的方法制成相同質(zhì)量濃度的槲皮素和金屬醋酸鹽溶液,供抑菌實(shí)驗(yàn)。用DMSO和無菌水為溶劑配制質(zhì)量濃度為30mg/mL、10mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL配合物的溶液,按1.3.2的方法測(cè)定濃度對(duì)槲皮素的化學(xué)改性產(chǎn)物抑菌作用的影響。測(cè)定(1)~(11)樣品,供試菌種選用樣品對(duì)其抑菌作用相對(duì)較強(qiáng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。1.3.4ph值對(duì)樣品的影響取濃度為10mg/mL配合物的溶液,進(jìn)行如下幾種方法處理:分別置于不同的溫度(20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃)條件下;將樣品調(diào)制成不同pH值(2、4、6、8、10)的溶液。根據(jù)1.3.2的方法研究槲皮素第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物的抑菌作用,以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo),測(cè)定槲皮素第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性,供試菌種選用樣品對(duì)其抑菌作用相對(duì)更強(qiáng)的金黃色葡萄球菌,其原因?yàn)?通過第一過渡系生命元素槲皮素配合物對(duì)幾種菌種抑菌活性的穩(wěn)定性初步測(cè)定發(fā)現(xiàn),有類似的變化規(guī)律,而選擇抑菌作用相對(duì)更強(qiáng)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)更有實(shí)際應(yīng)用意義。2結(jié)果與分析2.1不同質(zhì)量濃度下統(tǒng)一測(cè)序結(jié)果按1.3.1和1.3.2的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定(1)~(11)的樣品編號(hào),供試樣品質(zhì)量濃度均為10mg/mL,圓濾紙片的直徑為6mm,在37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后,用游標(biāo)卡尺測(cè)定其抑菌圈直徑,結(jié)果見表1。根據(jù)抑菌圈大小可以初步確定物質(zhì)的抑菌能力大小,抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越高。由表1數(shù)據(jù)分析可知,槲皮素第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的抑菌效果強(qiáng)于槲皮素和金屬醋酸鹽。金屬醋酸鹽中除了醋酸銅在較高質(zhì)量濃度下顯示弱的抑菌活性外,其他幾種金屬醋酸鹽在測(cè)定的幾種質(zhì)量濃度下沒有發(fā)現(xiàn)其抑菌作用,而同樣在此很低的濃度下,所得到槲皮素第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物仍然有明顯的抑菌作用;樣品編號(hào)(1)-(7)這7種配合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性較強(qiáng),但系列改性配合物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果接近,對(duì)枯草桿菌的抑菌活性強(qiáng)于啤酒酵母,而對(duì)啤酒酵母的抑菌作用稍大于槲皮素,說明這7種配合物對(duì)不同菌種的抗菌效果有一定差異,且有選擇性抗茵性能。而且槲皮素及其配合物抑制4種細(xì)菌的能力強(qiáng)弱順序相同,比較抑菌強(qiáng)弱得到:Qu-Cu>Qu-Zn>Qu-Co>Qu-Ni>Qu-Mn>Qu-Cr>Qu-Fe>Qu>Cu(Ac)2,可見,除Qu-Fe外,總體變化規(guī)律由周期表中第一過渡系生命元素槲皮素配合物自右向左減弱,并交叉變化,即相鄰奇電子數(shù)元素槲皮素配合物強(qiáng)于右方偶電子數(shù)元素槲皮素配合物,此研究結(jié)果未見文獻(xiàn)報(bào)道。按1.3.3的方法實(shí)驗(yàn),其結(jié)果見表2。槲皮素的7種改性產(chǎn)物配合物的抑菌作用,在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度的增大而增強(qiáng),呈劑量效應(yīng)關(guān)系。在4種測(cè)定的質(zhì)量濃度下,槲皮素的改性產(chǎn)物配合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用始終強(qiáng)于大腸桿菌,而抑菌作用強(qiáng)弱一致,其強(qiáng)弱為:Qu-Cu>Qu-Zn>Qu-Co>Qu-Ni>Qu-Mn>Qu-Cr>Qu-Fe>Qu。在質(zhì)量濃度增加過程中,槲皮素的改性產(chǎn)物配合物抑菌作用增加的幅度始終大于槲皮素。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí),槲皮素的改性產(chǎn)物配合物對(duì)金黃色葡萄球菌仍有一定的抑菌作用,但對(duì)大腸桿菌的抑菌作用很弱,而槲皮素對(duì)大腸桿菌幾乎沒有抑菌作用。2.3第一階段所需物質(zhì)的轉(zhuǎn)化活性物質(zhì)的穩(wěn)定性分析2.3.1抑菌效果測(cè)定按1.3.4的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的溫度對(duì)抑菌效果影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知,隨著溫度的升高,槲皮素的改性產(chǎn)物配合物抑制金黃色葡萄球菌的抑菌活性表現(xiàn)為穩(wěn)定性較好,抑菌效果變化不大,120℃處理后仍然具有較好的抑菌作用,而槲皮素在溫度小于60℃抑菌效果變化不大,但大于60℃后,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用逐漸下降,120℃處理后無明顯抑菌作用。總體上隨著溫度升高槲皮素的改性產(chǎn)物配合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用無明顯變化,而槲皮素隨著溫度的升高抑制作用逐漸下降。其抑菌強(qiáng)度規(guī)律:Qu-Cu>Qu-Zn>Qu-Co>Qu-Ni>Qu-Mn>Qu-Cr>Qu-Fe>Qu。2.3.2ph值對(duì)抑菌活性的影響按1.3.4的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得的pH值對(duì)抑菌效果影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知,在pH值為4~8范圍內(nèi),槲皮素的改性產(chǎn)物配合物抑制金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好,抑菌活性隨pH值升高變化不大,表現(xiàn)為穩(wěn)定性較好;在pH值為6時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好,而在pH值大于8以后,槲皮素配合物抑菌作用逐漸下降,到pH值為10時(shí),下降幅度增大。而槲皮素在pH值大于6以后對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果下降幅度比配合物大。在不同pH值時(shí),抑菌圈直徑均大于6mm。其抑菌強(qiáng)度規(guī)律:Qu-Cu>Qu-Zn>Qu-Co>Qu-Ni>Qu-Mn>Qu-Cr>Qu-Fe>Qu。綜合來看,槲皮素的改性產(chǎn)物配合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性均在pH值為4~8范圍內(nèi)較好,即在酸性到中性條件下更穩(wěn)定,而槲皮素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性在pH<6時(shí)隨pH值的變化不大,即在酸性條件下更穩(wěn)定。槲皮素改性產(chǎn)物配合物的抑菌活性在各種pH值下均比槲皮素的抑菌活性強(qiáng),且擴(kuò)大了pH值的穩(wěn)定性范圍。3抑菌活性測(cè)定—結(jié)論研究結(jié)果表明,第一過渡系生命元素對(duì)槲皮素進(jìn)行化學(xué)改性形成配合物后,這一系列的槲皮素配合物比槲皮素具有更強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)4種菌種的抑菌活性大小為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草桿菌>啤酒酵母;槲皮素配合物抑菌活性的相對(duì)大小為Qu-Cu>Qu-Zn>Qu-Co>Qu-Ni>Qu-Mn>Qu-Cr>Qu-Fe>Qu,且槲皮素配合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于槲皮素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,第一過渡系生命元素槲皮素配合物的抑菌活性比槲皮素更好,是值得進(jìn)一步研究和開發(fā)利用的新型活性化合物。用濾紙片法測(cè)定槲皮素配合物、槲皮素及過渡金屬醋酸鹽在相同質(zhì)量濃度下的抑菌效果,以抑菌圈直徑作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。打開無菌工作臺(tái)的紫外滅菌燈滅菌20min,然后用無菌水配制菌群液,用無菌吸管吸取1mL的無菌水,用無菌鐵圈蘸取不同菌種,在無菌水中攪拌均勻。吸取200μL剛配好的大腸桿菌菌液加到制備好的培養(yǎng)皿平板中,用無菌三角涂棒涂布均勻,將已涂布好的平板底皿做上記號(hào),每等份內(nèi)標(biāo)明一種溶液的編號(hào),每一區(qū)域貼上3片浸過不同溶液的小圓濾紙片,再將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放入恒溫箱中培養(yǎng),37℃培養(yǎng)24h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)定其抑菌圈直徑。用金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草桿菌分別代替大腸桿菌實(shí)驗(yàn)。分別比較不同樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草桿菌的抑菌活性。1.3.3和肽鏈上的羧基槲皮素第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好,原因是由