myod基因在3個(gè)黃牛品種中遺傳多態(tài)性分析

我的肌腱特征d最初是mio1，于1987年首次克隆。這是mrf的一個(gè)成員（我的d、mrf5、我的obg和mrf4）之一。MyoD基因不僅可促使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且能把許多種類(lèi)型細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等)轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并可促進(jìn)成肌細(xì)胞進(jìn)一步融合、分化為成熟的肌纖維，在成肌過(guò)程中起主導(dǎo)作用。現(xiàn)代肌肉發(fā)育生物學(xué)的研究表明，脊椎動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)潛力即肌纖維的數(shù)量在出生前就已決定，出生后數(shù)目不再改變，出生后肌肉的生長(zhǎng)主要靠肌纖維長(zhǎng)度和周徑的增大，而肌纖維的增粗又會(huì)影響肌肉的嫩度，從而影響其肉用品質(zhì)，由于MyoD基因的重要功能，近年來(lái)，它成為動(dòng)物肉質(zhì)改良育種的重要研究?jī)?nèi)容。在牛上的研究也逐漸興起。牛MyoD基因位于15號(hào)染色體，DNA共有2648bp，有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。田璐等、黃萌等報(bào)道中原黃牛MyoD基因的第2內(nèi)含子及第3外顯子上發(fā)現(xiàn)與胴體性狀密切相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，但其他位點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以MyoD基因的第2外顯子及第1外顯子編碼區(qū)部分序列為研究對(duì)象，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)我國(guó)西南地區(qū)3個(gè)地方品種黃牛———盤(pán)江牛、昭通牛及巴山牛的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，以期為我國(guó)南方黃牛的選育提供新的理論依據(jù)。1材料和方法1.1保肝活性碳的制備采集西南地區(qū)部分牛品種共136頭，其中，巴山牛56頭（重慶榮昌），盤(pán)江牛41頭（貴州關(guān)嶺），昭通牛39頭（云南昭通）耳組織1g置于75%酒精中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍保存。1.2方法1.2.1提取各組dna采用酚-氯仿法提取組織DNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度及濃度。1.2.2pcr擴(kuò)增nd基因根據(jù)GenBank(gi:119947342)登錄的牛MyoD基因序列，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物P1、P2分別擴(kuò)增MyoD基因的第2外顯子全部序列和第1外顯子編碼區(qū)部分序列。擴(kuò)增片段大小分別為319bp和256bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：1.2.3pcr反應(yīng)條件PCR反應(yīng)體系為20μL：其中包括10×PCRBuffer2.0μL，上下游引物(20pmol/L)0.5μL,TaqDNAPolymerase(5U/L)0.2μL,DNA模板(50～100ng/L)1.0μL,dNTP(2.5mmol/L)1.6μL，加ddH2O至20μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min后4℃保存，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.2.4聚丙烯酰胺凝膠法2μLPCR產(chǎn)物加入8μL的變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚蘭)，然后98℃變性10min后，迅速插入碎冰中，放置5min。樣品在預(yù)冷的12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Act:Bis=29∶1)中電泳。140V電壓電泳過(guò)夜，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶并記錄結(jié)果。1.2.5延長(zhǎng)產(chǎn)物的測(cè)量序列選取純合基因型個(gè)體，對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，送上海英駿生物公司測(cè)序。1.2.6基因型頻率的確定基因頻率和基因型頻率的計(jì)算。基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率。Pi為第i個(gè)等位基因的頻率；i為純合復(fù)等位基因；j1,j2,……,jn為與i共顯的第1到第n個(gè)等位基因基因型頻率指一個(gè)群體中某一性狀的各種基因型之間的比率。由于PCR-SSCP方法的檢測(cè)結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率。基因型頻率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體總數(shù)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)：Ei為理論值Oi為實(shí)際觀察值n為等位基因數(shù)。2多態(tài)性分析經(jīng)PCR-SSCP分析發(fā)現(xiàn)，在所擴(kuò)增的2個(gè)片段中，第1外顯子編碼區(qū)部分序列出現(xiàn)多態(tài)性，擴(kuò)增的第2外顯子部分序列未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，故只對(duì)第1外顯子編碼區(qū)部分序列進(jìn)行分析。2.1up-pcr擴(kuò)增用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)不同牛品種的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，引物的最佳退火溫度為58℃，在此溫度下，擴(kuò)增出MyoD基因的第1外顯子編碼區(qū)部分序列，片段大小為265bp左右。所得PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的目的片段明亮、特異性好（見(jiàn)圖1），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2pcr-scp檢測(cè)結(jié)果經(jīng)SSCP分析，第1外顯子存在單核苷酸多態(tài)，出現(xiàn)AA、BB、AB3種基因型。結(jié)果見(jiàn)圖2。2.3aa基因型的結(jié)構(gòu)對(duì)MyoD引物P1擴(kuò)增的2種純合子基因型AA和BB進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明：AA基因型的堿基序列與GenBank(gi:119947342）的序列一致，而B(niǎo)B基因型在782處有一個(gè)G→A的突變(圖3)，并導(dǎo)致了氨基酸的突變，使甘氨酸改變?yōu)榻z氨酸。2.4盤(pán)江牛和山所有權(quán)的基因型頻率特征由表l可見(jiàn)，在3個(gè)牛品種中，都檢測(cè)到了AA、AB和BB基因型，而且A等位基因?yàn)?個(gè)牛群體的優(yōu)勢(shì)等位基因，頻率較高。3個(gè)品種中，盤(pán)江牛AA基因型頻率最高，達(dá)到0.5365，而巴山牛和昭通牛則相對(duì)較低，分別為0.4465和0.2564。經(jīng)過(guò)X2適合性檢驗(yàn)，3個(gè)群體中X2值分別為1.282(P>0.05）、0.107(P>0.05）和0.264(P>0.05），證明盤(pán)江牛、巴山牛和昭通牛群體的MyoD基因第1外顯子編碼區(qū)部分782處G→A的突變均達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。3討論3.1我國(guó)西南地方黃油基因的分布格局MyoD基因是肌肉轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，位于肌分化基因的上游，具有很強(qiáng)的肌肉轉(zhuǎn)化能力，目前已成為眾多研究的焦點(diǎn)。MyoD基因在肉質(zhì)性狀改良方面也引起了人們的重視，在豬上研究較早，在牛上研究尚處于起步階段。田璐等、黃萌等研究了牛MyoD基因第2內(nèi)含子和第3外顯子區(qū)域多態(tài)位點(diǎn)，但其它位點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取MyoD基因的第2外顯子及第1外顯子編碼區(qū)部分序列，利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)我國(guó)西南地區(qū)地方黃牛的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果在我國(guó)地方黃牛第1外顯子上發(fā)現(xiàn)了新的等位基因，并證明此位點(diǎn)的突變?cè)诒P(pán)江牛、巴山牛和昭通牛3個(gè)群體中均達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，這種分布頻率的原因可能與品種產(chǎn)生歷史有關(guān)。我國(guó)南方黃牛多分布在山區(qū)及深丘地區(qū)，這些群體在各自相對(duì)封閉的環(huán)境中自然繁育而成，其基因分布相對(duì)比較平衡。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將采集南方地區(qū)更多的地方牛品種，擴(kuò)大研究的單位群體的數(shù)量，使研究更加準(zhǔn)確。3.2豬肉色及肌肉性狀的基因序列家畜的產(chǎn)肉性能與肌纖維的數(shù)量和生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系。肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化可以影響個(gè)體的肌肉生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量，故MyoD基因的結(jié)構(gòu)變異可能會(huì)影響一些與肌肉相關(guān)的生產(chǎn)性狀。Knoll等報(bào)道，豬的MyoD內(nèi)含子1有1個(gè)DdeIPCR-RFLP位點(diǎn)，MyoD的A突變基因具有使肌纖維生長(zhǎng)更充分，肌纖維變粗，面積增大的作用。A基因還具有增加胴體瘦肉率和眼肌面積，降低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴體長(zhǎng)度等提高胴體品質(zhì)的效應(yīng)，但A基因也會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)的劣變。朱礪等對(duì)MyoD基因在不同豬種中的PCR-RFLP遺傳多態(tài)性及其遺傳效應(yīng)的研究中得到了類(lèi)似的結(jié)果。TePas等的研究表明,豬高水平的MyoG,Myf-5和MyoD的mRNA表達(dá)，可以作為選擇較高水平增長(zhǎng)率的一個(gè)指標(biāo)。另外，在對(duì)瘦肉率進(jìn)行選擇的過(guò)中，MyoG與MyoD的比率也可以作為肉色與肌纖維組成比率的指標(biāo)。田璐等分析了基因位點(diǎn)多態(tài)性與肉牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，表明實(shí)驗(yàn)群體不同基因型對(duì)肉牛的宰前活重、胴體重、凈肉重、高檔肉重、眼肌面積等性狀的影響差異極顯著或顯著，并且AA型個(gè)體均高于AB型個(gè)體。黃萌等發(fā)現(xiàn)MyoD基因C1867T位點(diǎn)3種基因型對(duì)肉牛的背膘厚、大腿肉厚的影響差異極顯著或顯