蛋白質組學技術在骨肉瘤增生分化中的應用

蛋白質組的概念最早于1994年意大利諾奇可通過的二維電泳會議提出。蛋白質組是指一個細胞、組織或體液在特定時期所包含的全部蛋白質成分。蛋白質組學是對這些蛋白質成分全面分析的學科。由于它的整體性研究特點,蛋白質組學研究不依靠任何假設,而是不斷地產生新的假設。隨著人類基因組計劃的完成、后基因組時代的到來,人們意識到生命活動的最終形式是由蛋白質來完成的。蛋白質組的研究逐漸成為熱點,其技術在腫瘤、泌尿系疾病、消化系疾病、呼吸系疾病、營養性疾病等中的應用,將為臨床闡明各疾病發生機制、尋找新的診斷治療方法帶來希望。本文就蛋白質組學技術及其在骨科疾病中的應用研究進展作一綜述。1研究的科學蛋白質組學是通過生化、質譜等方法對細胞內全部蛋白質進行大規模研究的科學。臨床蛋白質組學研究主要有兩大技術路線,一個是應用組合蛋白質分離技術和質譜技術尋找疾病的生物學標記;另一個是利用已發現的生物學標記,經蛋白芯片技術達到診斷和治療疾病的目的。1.1雙向差異凝膠電泳2d-dige顯示最常用的蛋白質分離方法是雙向電泳。首先根據蛋白質等電點采用等電聚焦分離蛋白,然后經聚丙烯酰胺電泳法,按分子質量進行雙向電泳,分離后進行染色和蛋白點分析。通過軟件定量分析實驗組和對照組中蛋白點的不同密度。利用蛋白酶將感興趣的蛋白點從凝膠上切下,以質譜和序列數據搜尋鑒定蛋白。雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)顯示技術是一種新的蛋白分析策略,可最小化凝膠上蛋白點對比問題,使得樣本間蛋白點對比更加容易、更加準確。此技術應用Cy3和Cy5兩種熒光染色,兩種染料可一起結合到兩個相比較的蛋白質樣本上。標記的蛋白質樣本混合在一起,然后在雙向凝膠上溶解。Cy3和Cy5信號可單獨分離,按每個點的標記率可定量分析樣本間各自點的影像。盡管雙向電泳是蛋白質組分析技術中的一個標準技術,但仍存在一些缺點,如有限的運動范圍和分子大小范圍,缺少與質譜技術在線相互作用,因此產生了許多液相多向分離技術。1.2肽指紋譜技術的分析方法蛋白質鑒定的主要技術是質譜分析技術。質譜鑒定蛋白質有兩種主要方法,即肽指紋譜技術和串聯譜技術。肽指紋譜技術主要分析基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)的均值,鑒定所有胰酶消化產物的分子質量,然后與已知蛋白質序列胰酶消化后的肽段大小相比較。肽指紋譜分析對主要病例的特異性不夠。串聯譜技術加液相色譜技術,可鑒定含有復雜成分的特殊蛋白質而不需預處理。1.3y2h技術蛋白質相互作用分析技術主要有蛋白芯片技術和酵母雙雜交技術。蛋白芯片可分成功能芯片、分析芯片和反相芯片三類。功能芯片可用于分析生物化學成分,例如酶底物的相互作用,或蛋白質的相互作用。分析芯片的蛋白質(抗原或抗體)固定于支持物上,由芯片探測樣本,通過直接或間接標記與樣本結合。分析芯片的用途之一是在健康和疾病體液蛋白質中尋找不同的蛋白質。反相芯片的細胞溶解物、血漿或標本固定于支持物表面,并由特殊檢測物標記。酵母雙雜交(Y2H)技術利用真核轉錄因子中的DNA結合結構域(BD)和轉錄活化結構域(AD)相互接近而激活轉錄特性,由編碼BD和AD的DNA片段與需要研究的蛋白質cDNA分別構建重組體。將兩個重組體放在同一酵母細胞中表達,產生的融和蛋白質分別稱為誘餌蛋白和獵物蛋白。如果蛋白質之間存在相互作用,則BD和AD被拉近,轉錄活性恢復,即可激活下游報告基因的表達。因此,應用Y2H技術可分析已知蛋白質之間是否存在相互作用,確定發生相互作用所必需的功能域;也可從已知蛋白質出發,探索與該蛋白質存在相互作用的未知蛋白質;還可利用Y2H技術基于核酸操作的特點,對基因組結構已知的生物,在只知編碼蛋白基因而不了解具體蛋白質的情況下,實現蛋白質組范圍內的相互作用分析。蛋白質相互作用分析技術還有免疫共沉淀技術、DNA序列分析法、GST融合蛋白技術、噬菌體展示技術、熒光共振能量轉移顯微成像技術、原子力顯微技術、Biacore表面等離子體共振技術和蛋白酶足跡法等。1.4數據庫內容數據庫目前蛋白質組研究相關數據庫有蛋白質氨基酸序列數據庫、蛋白質結構域與家族數據庫、蛋白質高級結構及分類數據庫、蛋白質雙向電泳(2-DE)圖譜數據庫、蛋白質相互作用數據庫,以及各種類型的專一性蛋白質數據庫。蛋白質組研究涉及的軟件工具主要有蛋白質雙向電泳圖譜分析軟件、蛋白質鑒定工具、蛋白質結構分析與功能預測工具等,這些工具的應用可對蛋白質相關結構、性質與功能的實驗研究,起到一定的指導參考作用。2蛋白質組理論對骨科疾病的應用2.1蛋白質的獲得蛋白質組學技術有助于類風濕性關節炎和骨關節炎生物學標志的發展,擴展對此類疾病病因的理解,提高早期檢測和治療效果評價。deCeuninck等應用蛋白質組學技術研究新鮮的人關節軟骨細胞分泌或釋放的蛋白質,軟骨組織塊切小置于無血清培養基中培養,48小時后采用雙向電泳或非凝膠電泳耦合串聯質譜經抗體依賴的蛋白芯片檢測培養基中的蛋白質,結果鑒定出血漿淀粉樣P物質、維生素D結合蛋白、色素上皮源性因子、肺源性活性趨化因子、轉錄因子Lyl-1、血小板生成素、纖維蛋白原、血管生成因子及凝溶膠蛋白等先前在軟骨中沒有報道的蛋白質。此方法能夠鑒定人骨關節軟骨分泌、釋放的新蛋白,通過對比研究闡明蛋白質之間的相互關系,為大樣本人骨關節軟骨的系統研究提供了可行的技術路線,從而篩選出治療關節炎的有效生物靶標。2.2新型蛋白質組學研究骨質疏松癥是絕經后婦女的一種慢性疾病,對其骨代謝中雌激素的機制仍知之甚少。應用蛋白質組學技術研究骨質疏松癥取得了許多可喜的進展,例如發現了與成骨細胞分化有關的新蛋白質。Fan等應用蛋白質組學技術研究雌激素缺失在大鼠骨蛋白質表達中的作用,經雙向凝膠電泳、質譜和大鼠蛋白數據庫成功鑒定出3種明顯變化的蛋白質,即硫氧還蛋白過氧化酶-1、阻凝蛋白輕鏈肽-2和泛素化酶E2-17kD,其中泛素化酶E2-17kD已報道為雌激素相關蛋白,其余兩種則首次報道為骨質疏松相關蛋白;同時在實驗中設立中藥治療組,初步認為這3種蛋白質在絕經后骨質疏松癥發病及中藥治療過程中發揮著重要的調控作用。這些結果為闡明雌激素丟失相關骨質疏松癥的分子機制,提供了實驗依據。2.3骨肉瘤細胞系u2os細胞序列骨肉瘤是最常見的骨組織原發性惡性腫瘤,傳統治療方法(手術切除或截肢加輔助化療)的5年存活率僅為20%～50%。因此,在蛋白質水平了解骨肉瘤的發生、發展具有極其重要的意義。Kang等通過對殼二聚糖作用后人骨肉瘤細胞系U2OS分泌蛋白的變化,探討骨肉瘤機制。孫慶等采用雙向凝膠電泳分離骨肉瘤組和正常組總蛋白質并銀染顯色,ImageMaste圖像分析系統分析電泳圖譜,建立和優化了人骨肉瘤蛋白質組雙向電泳圖像分析法,結果顯示優化的雙向凝膠電泳圖像分析技術適用于骨肉瘤蛋白質組研究。Spreafico等應用蛋白質組技術鑒定人骨肉瘤細胞與成熟成骨細胞之間蛋白質組的差別,結果顯示有8個蛋白質高表達,可能與腫瘤增生和腫瘤生物學標記相關;同時發現前體成骨細胞中表達下調的蛋白質,這可能是成骨細胞分化的特殊生物標記。這些結果確定了細胞系與原代人骨肉瘤細胞之間的差異,顯示出蛋白質組技術在骨肉瘤細胞及成骨細胞研究中的廣泛前景。2.4正常-tof-ms檢測脊髓損傷及其修復機制一直是研究的熱點。由于對脊髓損傷后神經系統應答反應及再生修復機制知之不多,臨床上對脊髓損傷的治療至今仍缺乏有效的手段。蛋白質組學技術為從整體水平上探究脊髓損傷這類多基因、多蛋白參與的損傷修復過程,提供了新的技術路線。張世強等以大鼠橫斷損傷和正常大鼠脊髓為研究對象,經雙向電泳和銀染分別得到損傷和正常脊髓的蛋白質組雙向電泳銀染圖譜,經圖像掃描及圖像分析建立損傷和正常脊髓蛋白質組匹配差示圖譜,發現兩者之間存在411個差示蛋白,損傷脊髓蛋白質組中有155個蛋白點在正常脊髓蛋白質組相應的匹配蛋白點中未找到,正常脊髓蛋白質組中也有256個蛋白點在損傷脊髓蛋白質組相應的匹配蛋白點中未找到。Kang等經雙向電泳和MALDI-TOF-MS技術建立創傷性脊髓損傷組織全蛋白表達譜,檢測正常和創傷性脊髓損傷組織中全蛋白和特異蛋白的表達,發現947個全蛋白,并分析正常組織219個蛋白和損傷組織270個蛋白,創傷24小時后損傷脊髓組織表達上調的蛋白超過39個,表達下調21個,其中包括神經原纖維鏈、膜聯蛋白-5、熱休克蛋白、微管蛋白-β、外周蛋白、膠質纖維酸性蛋白和載脂蛋白A;功能分類分析顯示蛋白變化主要歸屬13個功能類別,其中損傷組織神經功能類最可能與損傷愈合反應過程中的神經再生和膠原再生相關。Ding等將成年大鼠胸椎板切除作為對照組,與胸脊髓橫斷模型進行對比研究,術后5天切下全部脊髓組織行蛋白質雙向電泳、質譜技術鑒定,并經Western印跡法進一步確定,結果發現脊髓損傷組有超過30個蛋白點上調,是椎板切除組的1.5倍,這些蛋白可能在脊髓損傷修復過程中扮演重要角色;按照這些蛋白的功能,可分為應激反應組、代謝改變組、脂和蛋白變性組、神經生存和再生組;特別是11個鋅指蛋白和磷脂酰肌醇蛋白聚糖的高表達,可能對軸突生長再生起抑制作用,且在新蛋白序列中有3個未知蛋白在脊髓損傷中上調。這些蛋白分子的發現,有利于進一步理解成人脊髓損傷不能再生的潛在機制。2.5差異蛋白的初步鑒定激素性骨壞死,尤其是股骨頭壞死產生的疼痛及最終的股骨頭塌陷、骨關節炎和關節功能喪失,給患者帶來嚴重的身心損害和經濟負擔。劉建仁等建立激素性骨壞死模型并設中藥治療組和空白對照組,采用蛋白質組學技術找到各組間差異蛋白點,進一步行膠內酶切和MALDI-TOF-MS分析,得到各差異點的肽指紋譜,最后結合蛋白質生物信息庫對各蛋白質進行初步鑒定,得到3個差異蛋白,分別為阻凝蛋白重鏈ⅡB、磷脂谷胱甘肽過氧分酶和泛素化酶E2-17kD,初步認為這3種蛋白質在激素性骨壞死發病及中藥治療過程中發揮重要的調控作用。Tan等應用蛋白質組學技術分析壞死股骨頭和正常股骨頭之間蛋白質的變化,發現纖溶酶原活化因子(t-PA)、骨源性谷氨酸蛋白(BGP)、c-sis基因和一未知蛋白在股骨頭壞死中表達下調,而纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、交聯蛋白(crosslaps)和抗p53抗體則上調,且t-PA、PAI-1、交聯蛋白和抗p53抗體在股骨頭壞死患者中的表達明顯高于類風濕性關節炎、骨關節炎和骨折患者。2.6腰椎半胱氨酸蛋白酶抑制劑以往對于椎間盤組織的基礎研究大多集中于膠原蛋白、蛋白多糖和彈性蛋白的改變,而對該組織的細胞外基質小分子蛋白的研究卻鮮有報道。Liu等應用雙向電泳技術分析正常椎間盤和腰椎間盤突出患者腦脊液蛋白質,發現腰椎間盤突出患者腦脊液中半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、載脂蛋白A、維生素D結合蛋白及神經微絲的3種L蛋白(免疫球蛋白G、連接素和血紅蛋白)升高,而血清淀粉樣蛋白、前列腺素D2合酶、肌酸激酶B及超氧化劑物歧化酶-1降低;這些蛋白質表達的改變,可能與腰椎間盤突出造成脊髓神經根受損有關。馮皓宇等取人正常椎間盤組織并萃取細胞外基質小分子蛋白質,采用固相pH梯度等電聚焦和梯度聚丙烯酰胺雙向電泳分別分離纖維環和髓核蛋白質,分析電泳圖像,應用MAL