天麻種子萌發菌的生物學特性及室內萌發效果研究

天麻是一種稀有的傳統中醫。它屬于蘭花科多年生共生草本植物。沒有根和綠色的葉子，所以你不能進行光合作用和自我完善。天麻種子細小如粉塵,無胚乳及其他營養貯備,如無外源營養供給,種子不能發芽,必需依靠小菇屬(Mycena)一類真菌侵染后才能正常發芽,其后的生長又需要蜜環菌菌索的侵入提供營養才能繼續生長完成其生活史。大量研究表明,不同萌發菌所提供的營養對天麻種子萌發和種子發芽后形成的原球莖生長均有較大影響。因此,分離、篩選出優良的萌發菌菌株,對提高天麻種子發芽率和天麻產量都有十分重要的意義。云南省昭通市是我國公認的天麻道地藥材產地,特別是昭通市彝良縣小草壩所產的天麻,以優良的品質而馳名中外。昭通市彝良縣小草壩的自然地理環境狀況和大氣、水源、土壤環境質量均完全符合GAP的要求,適宜于開展天麻GAP種植示范基地建設。然而昭通產區至今未見優良天麻種子萌發菌分離成功的報道,因此成功分離培養昭通本地優良萌發菌菌種,對昭通天麻生產和產業發展具有重要意義。1材料和方法1.1發芽菌的分離、繁殖和生長特性1.1.1這些材料來自剽竊萌發菌分離材料采自云南省昭通小草壩,為昭通神農公司下屬實驗室在小草壩野生天麻生長區播種烏天麻種子60d后形成的烏天麻原球莖。1.1.2生長特性觀察參照徐錦堂的方法進行。1.1.3菌落生長特性。取已純化好的擬定萌發菌菌種接入PDA培養基中,接種量為5mm(直徑)的圓形菌塊,于25℃下分別設光照、半光照和黑暗3種條件下進行培養,定期觀察菌落生長狀況及其生長特性。每處理設3個重復。1.2觸發性室內發芽試驗1.2.1天麻種子萌發試驗首先制備PDA平面培養基,然后將滅菌后的殼斗科植物葉片平鋪于培養基上,接種經分離純化獲得的萌發菌于培養基上,待葉片上長滿菌絲(15d)后,備用。1.2.2萌發試驗。剪取一定大小的海綿放入培養皿中,滅菌后倒入無菌水并在海綿上放一張已滅菌的濾紙,然后在無菌操作臺上,于濾紙上放菌葉3～4片,將天麻種子均勻的散播在菌葉上,于25℃下培養并定期觀察記錄。每處理設3個重復。1.3天麻種子萌發菌株和蜜環菌栽培種野外試驗于2008年6月下旬至7月上旬在云南昭通小草壩神農公司試驗地進行。選取室內萌發效果較好的SNm-01菌株為天麻種子萌發菌,萌發菌和蜜環菌栽培種由神農公司下屬實驗室制備,采用烏天麻種子拌萌發菌套蜜環菌播種,同時與本地使用的傳統蕨根套蜜環菌播種法進行比較。60d后(8月下旬)分別挖塘檢查天麻種子的萌發和生長狀況。每種處理設5個重復。2結果與分析2.1菌落生長和直徑采用天麻原球莖為分離材料(圖1),經分離、純化及篩選獲得2株擬定萌發菌純菌株SNm-01和SNm-02。2株菌具有基本相同的生長特性,在PDA固體培養基中生長時,形成白色均勻絨毛狀菌落,平均生長速度為0.54mm/d和0.32mm/d,培養14d時菌落直徑分別達75.6mm和44.8mm。2株菌菌絲無色透明,具有分隔、分枝和鎖狀聯合,生長旺盛,菌絲老化后細胞壁厚,都具有氣生菌絲,但SNm-01菌落中菌絲束有規則地呈螺旋狀彎曲,而SNm-02的氣生菌絲發達、成束狀,生長速度較快,在光照條件下較黑暗條件下生長良好。2.2子萌發菌的培養將天麻種子播撒在SNm-01和SNm-02菌株培養的菌葉上,經過一定時間后發現2株菌均能促進天麻種子萌發,為天麻種子萌發菌。但2株菌促進天麻種子萌發的時間和效果存在在較大差異,接種SNm-01的菌葉上的天麻種子在保濕培養24d后觀察到種子萌發,48d時可見菌葉上大量天麻種子萌發形成的原球莖(圖2),而SNm-02則萌發速度較慢,在播種26d后才觀察到天麻種子的萌發,且萌發的種子數較少,培養48d時菌葉上僅見局部區域內有少量天麻原球莖出現(圖3)。2.3原球莖出現的數量SNm-01菌株野外促天麻種子萌發及傳統播種天麻種子萌發結果見表1。表1結果顯示,與本地傳統蕨根套蜜環菌播種法相比,SNm-01野外促天麻種子萌發效果顯著,5個試驗塘中均有種子萌發,萌發最多的原球莖達到200個/塘,最少的原球莖也超過50個/塘,空穴率為零且至觀察時大部分原球莖已萌生初生球莖(圖4)。而采用傳統播種法的5個試驗塘中,僅3塘發現有天麻種子萌發,空穴率達40%,且萌發的種子數少(圖5),最多的1塘僅發現10個原球莖,遠遠低于萌發菌SNm-01菌株拌播法原球莖出現的數量。萌發菌SNm-01菌株不僅能有效促進天麻種子的萌發,對萌發后原球莖的生長也具有較好的作用,由SNm-01拌播的天麻種子形成的原球莖最大的可達到5×8mm,最小的為2×3mm,明顯大于傳統播種天麻種子形成的原球莖(最大的為2×3mm,最小的為0.8×1mm)(圖6、圖7)。3對天麻種子萌發菌的種類(1)通過分離獲得兩株昭通本地萌發菌——SNm-01和SNm-02,生長特性研究和萌發試驗結果顯示,2株菌的生長特性基本相同,但菌株SNm-01菌落生長速度較快,室內促天麻種子萌發的效果較好,種子萌發所需時間短,且萌發率較高。與傳統的播種方法相比,SNm-01在野外林間大田萌發實驗中同樣表現優良,不僅能有效提高天麻種子萌發率,對萌發后原球莖的生長也具有較好的作用,因此SNm-01是一株優良的昭通本地萌發菌。該萌發菌的獲得對提高昭通天麻產量,促進昭通天麻產業發展具有重要意義。(2)據報道目前已經鑒定到種的天麻種子萌發菌均屬于小菇屬(Mycena)真菌,分別為紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、蘭小菇(Mycenaorchidicola)、開唇蘭小菇(Mycenaanoectochila)、石斛小菇(Myc