電針天樞穴對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸平滑肌結(jié)構(gòu)及cajl間質(zhì)細(xì)胞的影響

緩慢傳播的便秘（stc）是一種緩慢存在的便秘，具有通過排便時(shí)間延長和腸道動(dòng)力降低的特點(diǎn)。近年大量研究表明,針刺天樞等穴治療STC取得了較滿意療效。但有關(guān)針刺取效作用機(jī)制研究的報(bào)道則很少。研究顯示,胃腸壁內(nèi)Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitialcellsofCajal,ICC)作為胃腸運(yùn)動(dòng)自主節(jié)律性的起搏細(xì)胞和興奮傳導(dǎo)細(xì)胞,具有產(chǎn)生電慢波、參與調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)的功能,與許多胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的研究目的在于通過觀察電針“天樞”穴對(duì)STC大鼠結(jié)腸平滑肌結(jié)構(gòu)及ICC的影響,探討電針“天樞”穴治療STC的作用機(jī)制,為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1造模、分組、培養(yǎng)健康清潔級(jí)Wistar大鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量100～120g,購自上海萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2007-0005]。隨機(jī)選取40只進(jìn)行STC造模,余20只為正常對(duì)照組。最后造模成功36只,將36只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組,每組各18只。1.2試驗(yàn)試劑與儀器復(fù)方苯乙哌啶(常州康普藥業(yè)有限公司),c-kit兔抗鼠多克隆抗體(美國SantaCruz公司),非生物素二步法檢測試劑盒、3%過氧化氫溶液、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)等均購自北京中杉公司,0.3mm×15mm毫針(蘇州華佗醫(yī)療器械廠),HANS-200A電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司),RM2145組織切片機(jī)(美國Leica公司),BX4-60生物光學(xué)顯微鏡(日本Olympus),DP71型顯微攝像系統(tǒng)(日本Olympus),JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(南京捷達(dá)公司)。1.3造模大鼠的飼料實(shí)驗(yàn)大鼠均分籠飼養(yǎng)于適宜的環(huán)境(16～25℃,相對(duì)濕度50%～70%,清潔安靜)。適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后,40只造模大鼠飼喂含復(fù)方苯乙哌啶的飼料,給藥劑量根據(jù)大鼠的體質(zhì)量及飼料消耗量計(jì)算為每日8mg/kg,將藥物混勻到飼料中讓大鼠自食。每隔7d稱量大鼠體質(zhì)量1次,根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。正常組飼以普通干飼料(飼料由南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制)。飼養(yǎng)時(shí)間為120d,不限飲水。采用首粒黑便排出時(shí)間判定模型成功建立與否。1.4“天樞”穴的測定電針組動(dòng)物于造模成功后電針雙側(cè)“天樞”穴。“天樞”穴定位采用擬人比照法,取大鼠胸腹正中線上,以劍突為一定位點(diǎn),以恥骨聯(lián)合上緣為另一定位點(diǎn),兩者連線的上2/3與下1/3的交點(diǎn)處旁開5mm為“天樞”穴。用特制鼠架將大鼠固定后,穴位周圍剪去腹毛,皮膚常規(guī)消毒,用毫針針刺5mm深,接HANS-200A型電針儀,電流強(qiáng)度為0.8～1.3mA,采用疏密波,2Hz/15Hz,治療15min。首粒黑便測定結(jié)束后,第2天開始治療,每天治療1次,連續(xù)治療14d。正常組及模型組用同樣鼠架固定,但不予其它處理。1.5免疫組化試劑制備模型建立測定:大鼠停藥3d后,禁食,不禁水24h,采用活性炭懸液灌胃法測定首粒黑便排出時(shí)間。經(jīng)口灌入50g/L活性炭懸液2mL(活性炭懸液的配制:準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠50g,加水400mL,煮沸至溶液透明,稱取活性碳25g加至上述溶液中煮沸3次,待溶液涼后加水定容到500mL,使用前玻璃棒攪拌混勻)。從活性炭懸液灌胃完畢開始計(jì)時(shí),記錄從灌胃到首粒黑便排出的時(shí)間。結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)HE染色:治療結(jié)束后,各組隨機(jī)取大鼠6只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。頸椎脫臼處死,立即取距盲腸端2cm處結(jié)腸1cm左右,從腸系膜處剪開,生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物,平鋪后4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,每例標(biāo)本連續(xù)切片2張,片厚5μm,裱于經(jīng)多聚賴氨酸防脫片劑處理的載玻片上,置60℃烤箱中12h,備用。切片脫蠟至水,蘇木精液染色7min;流水洗去蘇木精染液2s;1%鹽酸乙醇分化1～3s;流水沖洗30s;0.5%氨水返藍(lán);流水沖洗5min×3次;蒸餾水過洗1～2s;1%伊紅染色1min;蒸餾水過洗1～2s;乙醇梯度脫水,各5min;二甲苯脫水5min×3次;中性樹膠封片;顯微鏡觀察,每組取6張切片,每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野(10×40),應(yīng)用DP71型圖像獲取系統(tǒng)采集圖像,觀察結(jié)腸壁形態(tài)結(jié)構(gòu),并用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)直線測量軟件模塊測量結(jié)腸平滑肌厚度。ICC免疫組化染色:按照即用型二步法(非生物素)檢測免疫組化試劑盒說明書操作。石蠟切片制備如上;切片脫蠟至水;PBS浸泡5min;檸檬酸鈉、高壓修復(fù)抗原;自然冷卻3～5min后,浸入冷水,沖洗10min,取出冷卻至室溫;PBS浸泡5min,取出;置3%雙氧水中孵育10min,以滅活內(nèi)源性過氧化酶;用PBS液沖洗2min×3次;滴加適當(dāng)稀釋的兔抗鼠多克隆c-kit抗體(按1∶150稀釋),濕盒內(nèi)37℃孵育90min;PBS沖洗2min×3次;滴加二抗,室溫孵育30min;PBS沖洗2min×3次;DAB顯色10min;蒸餾水或自來水沖洗;蘇木素復(fù)染5min,然后控干;取出過水,鹽酸乙醇稍浸一下;自來水沖洗3次;浸在自來水中10min;乙醇梯度脫水,各5min;二甲苯脫水5min×3次;中性樹膠封片;顯微鏡觀察,細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色為ICC陽性細(xì)胞。每組取6張切片,每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野(10×40),應(yīng)用DP71型圖像獲取系統(tǒng)采集圖像,并用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算ICC免疫染色陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及平均吸光度值。1.6多組比較方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析,方差齊用LSD法檢驗(yàn),若方差不齊用Dunnett’sT3方法兩兩比較。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠腸道傳輸情況造模過程中,大鼠死亡4只,解剖后均發(fā)現(xiàn)結(jié)腸、直腸中充滿糞便,部分結(jié)腸擴(kuò)張充氣,平滑肌充血變薄,其中1只死亡前有嘔吐現(xiàn)象,1只消瘦明顯。經(jīng)首粒黑便排出時(shí)間測定,造模組大鼠首粒黑便排出時(shí)間較正常組明顯延長(P<0.05)。說明模型組與正常組相比,大鼠腸道傳輸速度明顯減慢,表明造模成功。最后共36只造模成功,模型成功率為90%。見圖1。2.2大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)圖2顯示,正常組大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞排列有序,腸黏膜腺體分布豐富。模型組大鼠平滑肌明顯變薄,尤其是內(nèi)環(huán)肌,最薄處只有3～4層肌細(xì)胞,并且見平滑肌細(xì)胞胞體萎縮,細(xì)胞之間出現(xiàn)分離,失去了緊密有序的正常排列;縱肌也有變薄,但不如環(huán)肌變化明顯;腸黏膜的腺體萎縮,腺泡減少,分布稀疏。電針組大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常組類似。3組大鼠結(jié)腸肌層厚度測量結(jié)果顯示,模型組與正常組、電針組比較明顯變薄(P<0.05),電針組與正常組結(jié)腸肌層厚度接近(P>0.05),提示電針組大鼠結(jié)腸平滑肌厚度較模型組有所改善,接近正常大鼠結(jié)腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)。2.3電針大鼠結(jié)腸小鼠理能力的變化顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常組ICC的胞體和突起呈棕黃色,胞體較大,呈紡錘形、橢圓形或梭形,可見2個(gè)或2個(gè)以上的突起,相鄰ICC形成帶狀或網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),以肌間叢區(qū)域最豐富;模型組ICC形態(tài)及分布與正常組類似,但著色較淡、模糊,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不連續(xù);電針治療后,電針組ICC形態(tài)、分布、細(xì)胞著色及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整性均接近于正常組。模型組大鼠結(jié)腸平滑肌ICC免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均吸光度值與正常組比較顯著降低,電針組與模型組比較明顯升高(均P<0.05);電針組大鼠結(jié)腸平滑肌ICC免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均吸光度與正常組接近(P>0.05)。見圖3。3電針組大鼠結(jié)腸第二、三應(yīng)性及病理改變STC的發(fā)病因素多種多樣,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,是近年研究的重點(diǎn)。研究顯示,STC發(fā)病與腸神經(jīng)系統(tǒng)、ICC細(xì)胞、平滑肌病變以及生活習(xí)慣、心理因素等眾多因素相關(guān)。結(jié)腸平滑肌是胃腸道將化學(xué)能轉(zhuǎn)換為機(jī)械能的最終執(zhí)行者,它的形態(tài)異常和運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)會(huì)直接影響到結(jié)腸的收縮與舒張。研究發(fā)現(xiàn)STC患者結(jié)腸平滑肌內(nèi)有包涵體形成,而平滑肌細(xì)胞內(nèi)大量包涵體的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致平滑肌收縮性下降,進(jìn)而減慢胃腸傳輸速度。Altomare等的研究證明,58%的嚴(yán)重STC患者結(jié)腸壁變薄,肌細(xì)胞空泡變性或脂肪變性,環(huán)肌萎縮,病變呈進(jìn)行性過程,提示了STC患者有平滑肌肌病的存在。ICC是1893年由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal于胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)的非神經(jīng)性間質(zhì)細(xì)胞。ICC分布于食管中下段至乙狀結(jié)腸的腸管壁各層及少數(shù)括約肌,胞體呈紡錘型或星狀,核大而胞質(zhì)少,有2～5個(gè)細(xì)長的突起,在胃腸道運(yùn)動(dòng)中為慢波電位的起搏細(xì)胞,并推進(jìn)電活動(dòng)傳播,介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)傳遞。Maeda等發(fā)現(xiàn)ICC細(xì)胞膜可特異性表達(dá)c-kit,是一種由c-kit基因編碼的跨膜糖蛋白,屬于酪氨酸激酶受體家族第三亞類。c-kit與其配體干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合所啟動(dòng)的信號(hào)通路對(duì)ICC的發(fā)育、分化及表型維持至關(guān)重要。目前研究證實(shí),STC結(jié)腸伴有ICC數(shù)量、形態(tài)及功能的變化。Wedel等觀察到,STC患者結(jié)腸ICC的數(shù)目顯著減少,且ICC突起連接雜亂或不能相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。于彬等同樣發(fā)現(xiàn)STC患者乙狀結(jié)腸壁內(nèi)ICC的數(shù)量均較正常對(duì)照組減少,且突起的分支亦減少,彼此間不能形成完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。電鏡見ICC內(nèi)溶酶體聚集、脂質(zhì)沉積,突起間的縫隙連接較小、數(shù)量減少。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠結(jié)腸腸壁形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯的病理變化,提示STC患者排便困難與結(jié)腸平滑肌病理改變相關(guān)。而電針組平滑肌細(xì)胞形態(tài)趨于正常,平滑肌肌層厚度與正常組接近,說明電針“天樞”穴可能是通過改善結(jié)腸腸壁的這種病理改變而達(dá)到治療目的