第五章分子生物學(xué)研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)基因操作：主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。

基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。因此，基因工程技術(shù)其實是核酸操作技術(shù)的一部分。

從20世紀中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。

基因工程也稱為重組DNA技術(shù)。嚴格地說，DNA重組技術(shù)并不完全等于基因工程。基因工程是重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。

重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。

1、重組DNA技術(shù)回顧2、DNA基本操作技術(shù)3、RNA基本操作技術(shù)4、基因克隆技術(shù)5、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)本章主要內(nèi)容：Contents三大成就：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae5.1重組DNA技術(shù)回顧1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團

到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復(fù)制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。分子克隆的載體----具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交Contents1、重組DNA技術(shù)2、DNA基本操作技術(shù)3、RNA基本操作技術(shù)4、基因克隆技術(shù)5、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.2

DNA基本操作技術(shù)

5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。

基本原理根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子(磷酸基團)，在電場中會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。稱樣溶解加熱電泳操作基本程序側(cè)視俯視制板倒膠樣品制備DNA樣品每條帶>100ng上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍/二甲苯青

電泳溴化乙錠（EB）是一種具扁平分子的核酸染料，可插入DNA或RNA分子的堿基之間，并在300納米波長的紫外光下放射出熒光，指示出凝膠介質(zhì)中DNA譜帶的位置；而在適當染色條件下，電泳譜帶的熒光強度是同DNA片段的大小成正比的。紫外燈下顯色凝膠成像系統(tǒng)Mmarker1.2普通Taq酶3.4hotstartTaq酶細菌轉(zhuǎn)化：細菌菌株由于捕獲了外源DNA導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。大腸桿菌是分子生物學(xué)家常用的實驗材料，也是基因工程重要的實驗菌株。5.2.2細菌轉(zhuǎn)化供體菌株、受體菌株、感受態(tài)細胞、陽性克隆細菌轉(zhuǎn)化方法CaCl2法、電擊法（電脈沖）、體外包裝法（噬菌體）大腸桿菌低溫(0℃)預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，外源DNA粘附在細胞表面，立即將其轉(zhuǎn)到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA被細胞所吸收（感受態(tài)）。5.2.3聚合酶鏈式反應(yīng)聚合酶鏈式反應(yīng)即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或某一特定DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。【開發(fā)史】

這項技術(shù)的發(fā)明人是KaryMullis。1983年，在一家生物高技術(shù)公司（Cetus）工作的Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段DNA的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州101號高速公路上，靈機一動想到了一個實際上可以無限擴增某段DNA的簡單方法，即PCR。在1985年的一次學(xué)術(shù)會議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學(xué)家中也引起了鏈反應(yīng)。大家很快地紛紛采用這個方法，很多人還很奇怪自己怎么沒有首先想到這么做。Cetus給了Mullis一萬美元的獎金，隨后把這項技術(shù)的專利以三億美元的價格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。在短短的幾年內(nèi)，PCR迅速成為分子生物學(xué)的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛的實際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項技術(shù)突破。1993年，Mullis因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。

1.變性（90℃-96℃）

在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火（25℃-65℃）

是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。3.延伸（70℃-75℃）

從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。標準的PCR過程分為三步：

PCR反應(yīng)體系引物dNTPMg2+Taq聚合酶模板反應(yīng)緩沖液PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

電泳分析PCR設(shè)備電泳分析在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究上，ＰＣＲ被廣泛地用于基因克隆和制造突變。研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……PCR技術(shù)的應(yīng)用

在臨床醫(yī)學(xué)上，PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。用傳統(tǒng)的方法，要檢測病毒、病菌的感染需要把病原體培養(yǎng)數(shù)周才能鑒定，而現(xiàn)在用PCR，即可以迅速判斷人體細胞（比如血液細胞）中是否存在病毒、病菌的DNA（比如HIV的DNA）而確診。在法醫(yī)上，PCR目前已成為發(fā)現(xiàn)罪證的重要方法。比如，0.1微升的唾液痕跡所含的DNA就可以通過PCR擴增而獲得足夠量的DNA進行測序鑒定罪犯。毛發(fā)、血跡、唾沫、精液因此都可以成為重要的罪證。利用PCR技術(shù)，科學(xué)家們已從林肯的頭發(fā)和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千萬年前的昆蟲、恐龍的骨頭等不尋常的樣品中提取了足夠的DNA進行研究。博物館中的化石標本都有可能成為遺傳學(xué)的研究對象，一門分子古生物學(xué)因此誕生。5.2.4.實時定量PCR常規(guī)PCR方法的局限性：無法對起始模板準確定量,只能對終產(chǎn)物進行分析必須在擴增后用電泳方法分析,費時費力而且EB有毒無法對擴增反應(yīng)實時檢測

實時定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過標準曲線對樣品中的目的DNA(或cDNA)的起始濃度進行定量的方法。Real-TimePCRPCR儀+監(jiān)測、分析系統(tǒng)+熒光標記

llll非特異性熒光標記：SYBRGreen特異性熒光標記：TaqManMolecularBeacon

DNA產(chǎn)物的熒光標記SYBRGreen工作原理

SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen

5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation約497nm約520nmCleavageProbes(TaqManTM)Taqman探針：與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（50-150bp）Molecularbeacon法(分子信標)標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針定量原理:介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析擴增曲線:熒光檢測元件擴增曲線可分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。

熒光閾值熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般將熒光域值設(shè)置為3-15個循環(huán)的熒光信號標準偏差的10倍。Ct值Ct值定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Ct值的重現(xiàn)性:Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample絕對定量25

相對定量：通過內(nèi)標定量

內(nèi)標通常是β-actin等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量5.2.5.基因組DNA文庫的構(gòu)建從生物組織細胞提取出全部DNA將其切成預(yù)期大小的片段，分別與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細菌或細胞，形成克隆。這樣每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫。基因組DNA文庫可用于分離特定的基因片斷、分析特定基因結(jié)構(gòu)、研究基因表達調(diào)控、還可用于全基因組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測定。基因組DNA文庫的構(gòu)建過程5.1重組DNA技術(shù)回顧5.2DNA基本操作技術(shù)5.3RNA基本操作技術(shù)5.4基因克隆技術(shù)5.5蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)1、總RNA的提取2、mRNA的純化3、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA4、cDNA文庫構(gòu)建5、基因文庫的篩選5.3RNA基本操作技術(shù)1總RNA的提取RNA易遭降解，實驗要求較嚴格。總RNA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。用試劑盒提取總RNA加入與生物素相連的寡聚(dT)引物溫育加入與微磁球相連的抗生物素蛋白用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA洗脫得到mRNA2、mRNA的純化cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。3、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以寡聚dT或隨機6核苷酸為引物反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第一鏈以cDNA第一鏈為模板合成cDNA第二鏈加接頭準備與載體連接4、cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。R