ssr標記的研究進展

遺傳標記是指在遺傳分析中用作標記的基因，也稱為標記基因。它可追蹤染色體、染色體的某一節段或某一個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。目前,應用較為廣泛的遺傳標記主要有形態標記(morphologicalmaker)、細胞標記(cytologicalmaker)、生化標記(biochemicalmaker)和分子標記(molecularmaker)。前3類遺傳標記都是對基因的間接表達,并且標記位點少,多態性差,容易受到環境因素、季節變化等影響,因此發展比較緩慢。分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的一種較為理想的遺傳標記形式,它以蛋白質、核酸分子的突變為基礎,檢測生物遺傳結構及其變異。分子標記技術從本質上講都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產生的變異來反映生物個體之間的差異。廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質,狹義的分子標記指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。目前廣泛應用的DNA分子標記有三代,分別為第一代的限制性片段長度多態性(RFLP),隨機擴增多態性DNA(RAPD),第二代的擴增酶切片段長度多態性(AFLP),簡單序列重復長度多態性(SSR),第三代的單核苷酸多態性(SNP)等。本文主要對SSR分子標記技術的原理、特點以及在作物遺傳育種中的應用進行概述。1ssr標記多態性和穩定性差SSR也稱為微衛星DNA(microsatelliteDNA)、短串聯重復(tendom-repeats)或簡單序列長度多態性(simplesequencelengthporlymorphism),它通常是指以2~5個核甘酸為單位多次串聯重復的DNA序列,也有少數以1~6個核甘酸為串聯重復單位。串聯重復次數一般為10~50次,如(A)n、(TC)n、(TAT)n、(GA-TA)n、(GA)n、(AC)n以及(GAA)n等。同一類微衛星DNA可分布在基因組的不同位置上,長度一般在100bp以下。由于重復次數不同,從而造成了每個位點的多態性(Akkayaetal.,1992;Wangetal.,1994;向道權等,2001)。每個SSR兩端的序列一般是相對保守的單拷貝序列,通過這段序列可以設計一段互補寡聚核苷酸引物,對SSR進行PCR擴增,由于SSR多態性多由簡單序列重復次數的差異引起,通常表現為共顯性。SSR擴增產物通常采用高濃度的瓊脂糖膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。目前,在所應用的標記中,RFLP標記所需DNA量較大,步驟較多,周期長,制備探針及檢測中要用到放射性同位素,成本高(邢晉祎和帥素容,2001);RAPD標記因使用的引物比較短,對反應條件極為敏感,稍有改變便影響擴增產物的重現,重復性較差,穩定性不好。另外,RAPD是顯性標記,不能區分純合基因型與雜合基因型,無法直接用于基因型分析(劉世濤等,2003);AFLP標記費用比較昂貴,且方法需經多步操作,統計分析困難,對DNA的純度和內切酶的質量要求很高(姚紅偉等,2009);SNP提供的信息較少,且費用較高(李偉等,2009)。相比之下SSR標記具有了以下優點:(1)數量豐富,覆蓋整個基因組,揭示的多態性高。(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高。(3)共顯性遺傳,不易被自然選擇和人工選擇所淘汰,符合孟德爾遺傳定律(DavidandMichael.,1994;Deveyetal.,1996)。(4)易于利用PCR技術分析,對DNA質量要求低,用量少,不需使用同位素,即使是部分降解的樣品也可進行分析。(5)每個位點由設計的引物順序決定,便于不同的實驗室相互交流合作開發引物。2中國西部小麥ssr標記多態性分析遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,蘊藏在各種生物的基因組中。在作物育種過程中,無論采用選擇或雜交等常規手段,還是依靠細胞雜交、原生質體融合和轉基因等生物技術輔助手段改良作物的遺傳特性,都離不開對遺傳資源進行系統化的遺傳多樣性的研究。利用SSR標記的高多態性,結合相關分析、聚類分析等數量遺傳分析手段,可以對不同親緣物種進行分類,判斷其親緣關系,評價不同品種的異質性,并進而劃分雜交優勢群。Manifesto等(1999)對阿根廷的105份小麥品種用位于不同染色體上的探針檢測后發現親緣關系越近的品種,指紋譜的相關系數越高。Zhang等(2006)用30個SSR標記對來自阿曼的6個小麥品種間的遺傳聯系和多樣性水平的調查表明,3個硬質小麥總的遺傳多樣性高于3個面包小麥,聚類分析還發現阿曼面包小麥不同于其它品種,然而2個巴基斯坦品種有點接近阿曼品種,可能存在某種未知的聯系。在小麥遺傳多樣性變化動態研究中,Wang等(2007)利用206對SSR引物檢測中國西部三省小麥的遺傳多樣性,通過遺傳距離以及聚類分析顯示發現云南與西藏小麥品種親緣關系比云南與新疆以及西藏與新疆的都要近。王利鋒等(2009)利用表型和SSR標記基因型,對88份有代表性的河南省玉米地方品種進行遺傳多樣性分析,發現這些地方品種農藝性狀表現出較大差異,表型聚類將其劃分為7個類群,大部分品種聚在一個類群內,但仍有部分品種獨立成群。呂廣磊等(2009)采用64個SSR標記對96份云南水稻(Oryzasativa)地方品種和選育品種的遺傳多樣性進行比較分析,結果表明SSR標記能較好地區分云南栽培稻品種,且云南水稻地方品種遺傳多樣性豐富,存在大量的優質性狀可供育種實踐選擇。徐靜靜等(2009)用FastPCR軟件在大豆疫霉全基因組中搜索到1234個含2~4個重復基元精確SSRs。選擇260個SSRs設計引物,經對大豆疫霉5個分離物的基因組DNA檢測,有212對(81.5%)有效擴增出SSR特征條帶,112對(52.8%)擴增多態性。用18對多態性SSR引物分析了來自美國、中國黑龍江省和福建省大豆疫霉分離物的遺傳多樣性,發現黑龍江省和福建省分離物的遺傳距離最近,美國和福建省分離物的遺傳距離最遠,大豆疫霉中國分離物與美國分離物可能具有共同的祖先,中國分離物可能為外來種。中棉所陳光和杜雄明(2006)人利用SSR分子標記對20世紀50年代我國引入海島棉以來培育的45個國內品種(系)及8個國外品種的遺傳多樣性進行研究,結果53個品種被分為兩大類,與系譜來源一致。3ssr分子標記技術在基因定位和分子輔助標記中的應用3.1ssr標記與小麥品種的關系SSR技術是尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記為遺傳育種早期選擇提供不受環境影響的遺傳標記。同時對目標基因進行精確的定位,也是進一步分離、克隆和導入目標基因的前提。唐媛等(2008)以感白粉病小麥品種中國春與101-3雜交后代F2為材料,用65對6B染色體上和9對6A染色體上小麥微衛星引物,進行連鎖分析,發現小麥微衛星標記Xgwm570與PmX有(9.72±2.40)cM的遺傳距離,該結果表明,PmX位于小麥染色體6BL上。陳立軍等(2009)針對中國大豆灰斑病1號生理小種,以抗所有生理小種的品系東農40566為母本,以感所有生理小種的品種東農410為父本配制雜交組合,雜交得到F2代后連續自交3代得到F5代群體。該群體經人工接種灰斑病1號生理小種后,利用BSA法對500個SSR標記進行篩選,其中3個標記Satt565、SOYGPATR和Satt396在抗、感池間表現出穩定的多態性,并且在F2代個體中表現出抗性與多態性協同分離的趨勢。3個標記與抗性基因的連鎖順序為Satt565-SOYGPATR-Hrcs1-Satt396,其與抗性基因的連鎖距離分別為12.7cM、6.5cM和14.7cM。推測抗大豆灰斑病1號生理小種的基因可能位于C1連鎖群上。3.2ssr標記在水稻抗性研究中的應用分子標記輔助選擇是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記來判斷目標基因是否存在(趙衛國等,2006)。因為SSR分子標記的共顯性標記,正適用于功能基因或QTL定位研究,便于在育種中對有關的功能基因或QTL的遺傳動態進行跟蹤,如目標基因與某個分子標記緊密連鎖,則通過對分子標記基因型的檢測,就能獲知目標基因的基因型。分子標記輔助較傳統的育種方式有育種周期短、不受外界條件干擾等優點,因而效果顯著。Zhang等(2009)在研究水稻開花期QTLs與耐熱性的遺傳效應關系時,利用單標記分析發現,SSR標記染色體4號上的RM3735位點以及染色體3號上的RM3586位點與耐熱性有明顯的關系,尤其是RM3735位點可用于水稻耐熱性方面的分子輔助育種研究。滕衛麗等(2008)對70份大豆種質資源進行了抗病性鑒定,并利用抗性相關的SSR標記驗證抗病毒分子輔助選擇育種的可行性。結果表明:接種SMV1和SMV3,選出雙抗種質17份;單抗種質9份;雙感種質44份。利用與抗SMV3相關的SSR標記Satt114和Satt362進行檢測,抗病毒資源篩選的準確率分別達到82.4%和68.8%;利用與抗SMV1相關的SSR標記Satt114、Satt362、HSP176、Satt510、Satt334和Sct_033進行檢測,HSP176標記達82.8%,Satt114、Satt510和Satt334標記均達70%以上,可以用作抗病毒分子輔助育種的選擇標記。70份大豆種質資源經聚類可劃分為兩大類群,Ⅰ類群為感病群,Ⅱ類群為抗病群,分組準確4ssr圖譜的構建高密度分子標記遺傳圖譜的構建是分子標記輔助選擇以及基因定位的基礎。經典的遺傳圖譜是根據形態、生理和生化標記構建的,由于這些遺傳標記數量在作圖群體的兩親本上極為有限而且圖譜分辨率飽和度不高,所以發展緩慢。隨著分子標記的迅速發展,促進了遺傳圖譜構建,以SSR分子標記為主遺傳圖譜構建的基本原理是以SSR位點為基礎,在基因組中每隔一定距離找一個多態性的SSR標記,當這些標記達到足夠的飽和度后則可利用SSR標記找到基因組中的任何功能基因或數量性狀位點(quantitativetraitloci,QTL),并進行連鎖分析,確定該功能基因或QTLs的位置。陳慶全和張玉光(2009)利用兩個優良的秈型水稻恢復系T219和T226衍生的202個重組自交系(RILs)作為作圖群體,構建了水稻全基因組連鎖圖譜。圖譜共包括181個簡單重復序列(SSR)分子標記,圖譜總長1559.6cM。該圖譜與多數已經發表的圖譜相比具有較好的一致性。同時檢測到偏分離標記有33個,除第4、第7和第9染色體沒有偏分離標記外,其余染色體都存在偏分離標記,絕大多數偏分離標記偏向于T226。Song等(2004)用439對SSR引物對2個親本By804(BHO群體)和B73進行多態性檢測,在F2和F3群體中獲得153個共顯性標記位點,構建了包含151個SSR標記位點高油玉米分子標記連鎖圖,圖譜總長度為1759.1cM,相鄰兩標記間的平均距離為11.65cM,而且在F2群體中定位了27個影響玉米籽粒油分含量的QTL。黃燕娟等(2008)利用1103對SSR引物(其中716對來自已報道的SSR引物,387對新開發SSR引物)對明恢86與93-11、02428和中花15的多態性進行PCR分析,結果分別檢測到多態性標記281個、473個和470個,多態性頻率分別為25.48%、42.88%和42.61%。根據各標記在染色體上的電子遺傳距離,利用Mapdrawevenmarker軟件,構建了3張基于明恢86的SSR電子遺傳圖譜。Cregan等(1999)將3種不同群體構建的3個大豆遺傳圖譜整合成1張含有20個連鎖群的大豆圖譜,共有1423個標記,其中SSR標記606個。Nguyen等(2004)利用SSR分子標記構建了陸地棉的分子遺傳圖譜,圖譜長度達5519cM,共具有1160個標記位點。近年來發展起來的一種基因克隆技術,圖位克隆(map-basedcloning)又稱定位克隆(positionalcloning),1986年首先由劍橋大學的Coulson等(1986)提出。利用分子標記輔助無須事先知道基因的DNA序列,也不用了解基因的表達產物是什么就可以直接克隆基因。圖位克隆技術首先在擬南芥中取得成功,后來在番茄(Fraryetal.,2000)、大麥(Fengetal.,2005)、小麥(凌宏清和Beat,2001)、甜菜(Hohmannetal.,2003)中也利用了這一方法。在水稻中,高精密遺傳圖譜和物理圖譜的構建成功(Yuetal.,2002),以及全基因組測序結果的公布(Goffetal.,2002;Chenetal.,2002),為水稻基因的精細定位以及后續的圖位克隆創造了優越的條件。李家洋研究小組克隆了MOC1基因,該基因表達的蛋白能夠促進腋芽的分生(Lietal.,2003)。中科院院士Sun等人、華中農業大學教授張啟發(Wuetal.,2008)領導的“基因組研究與水稻遺傳改良”國家創新團隊首次發現并成功克隆調控水稻開花時間、影響其生長周期的基因。5在測定品種和純度時應用ssr分子標記技術5.1綏農14自交系的遺傳關系近年來,由于骨干自交系的頻繁使用,導致品種間的遺傳基礎日趨狹窄,用傳統鑒定方法難以判別品種和親本自交系之間的親子關系,用SSR分子標記技術,便可解決這一難題。SSR能直接反映個體間DNA水平上的差異,具有高度的專一性和特異性。姚文華等(2009)利用SSR標記技術對23份玉米自交系和4個測驗種進行雜優類群研究,從117對引物中篩選出77對擴增帶譜清晰且具有多態性的SSR引物,在供試材料中檢測到398個等位基因變異,計算27個自交系間的遺傳距離(GD)在0.1074~0.4380,平均0.2880。GD大于0.3100的組合具有明顯產量優勢,GD小于0.2880組合的產量優勢較弱。根據分子聚群并結合產量。和系譜來源分析,將27份自交系劃分為3個雜種優勢群。秦君等(2008)利用Treeco(Neighbour-joining方法)對綏農14系譜親本進行聚類,發現綏農14系譜親本隨培育時期不同而聚在不同類別,與親本來源及組合方式存在一定的關系。分析綏農14系譜中遺傳物質的傳遞,發現在12.97%的位點上子代擁有與父母本均不相同的等位變異,品種育成年代越早這種現象越明顯。47.72%的位點能夠追溯到親本來源,除綏農14接受父母本遺傳物質相當外,其它4個品種均有偏親現象,來自父本的遺傳物質多于母本。經過5代的遺傳重組,綏農14的遺傳物質與祖先親本相比已發生了很大的改變。綏農14及其系譜親本的遺傳關系反映了品種更新換代的特征及組合方式的變化。張杰等(2009)利用87對多態性SSR和EST-SSR引物,對57份棉屬種間雜交漸滲系及其6個代表性血緣親本進行了鑒定分析。共檢測到540個等位變異,多態性等位變異占95.8%,EST-SSR變異占63.9%,41個SSR標記定位在棉花基因組的22條染色體上。種質間成對相似系數為0.553~0.937,平均為0.748。漸滲系的SSR聚類與種質材料的系譜來源基本吻合,而和農藝性狀聚類結果相差很大,前者更能反映其親緣關系。5.2ssr分子標記的應用種子純度是評價種子質量的主要指標,種子純度的降低會明顯降低農作物產量和產品品質。因此對雜交種子純度的快速、準確、有效的鑒定顯得十分重要。近年來,分子生物學的發展使品種純度檢驗進入到基因水平。品種間形態、生化及DNA分子標記上的區別,歸根到底是品種間在基因序列及表達上的區別。分子鑒定是以品種DNA片段作為檢測對象,采用電泳方法檢測基因組DNA結構與組成,通過分析DNA水平上的差異來檢驗品種純度,有很高的準確性、穩定性和重復性,因而可以鑒定品種的真實性和純度。目前,以PCR擴增為基礎的SSR標記技術在此領域展示了廣闊的應用前景。蔣益敏等(2009)以南校18號玉米雜交種及其親本自交系為材料,對胚芽和干種子的DNA進行提取,對24對SSR引物進行篩選,有3對特異性引物6mmc0241、umc2025、phi323152可用于南校18號雜交種和親本自交系的純度鑒定。黃成志等(2009)利用SSR分子標記鑒定雜交水稻種子中優88、協優88和全豐優88的真偽和純度,并將鑒定結果與田間鑒定結果進行比較。發現3個雜交種的SSR分子標記鑒定和田間鑒定的結果基本上一致,沒有明顯的差異,說明用SSR檢測雜