高壓氧聯合抗震顆粒與美多芭對實驗性帕金森病大鼠黑質bcl-2、bax表達的影響

帕金森病的病因尚不清楚，這是一種慢性進展緩慢的中樞神經系統退行性疾病。到目前為止，沒有一種絕對有效的治療方法和藥物可以治愈這種疾病，也沒有阻止病史發展的基本方法。2009年10月至2010年6月我們對比觀察了高壓氧聯合抗震顆粒與臨床上治療帕金森病的“金標準”藥物——美多芭對帕金森病模型大鼠黑質Bcl-2、Bax基因表達的影響,旨在尋求有效的神經保護性治療措施,為高壓氧結合抗震顆粒治療帕金森病提供理論及實驗依據,現報告如下。1材料和方法1.1體質量、鼠齡健康雄性Wistar大鼠40只,SPF級,由廣西醫科大學醫學實驗動物中心提供(SCXK桂2009-0002),體質量(260±10)g,鼠齡12～15周。飼養條件:室溫(25±5)℃,濕度(60±20)%,飼以實驗動物中心提供的飼料(成分有大米粉、玉米粉、魚粉、奶粉、麥麩、多維素、魚肝油、雞蛋以及鹽等)。自由攝食、飲水。1.2主要試劑和儀器美多芭(上海羅氏制藥有限公司,國藥準字H10930198),每片250mg。抗震顆粒由本實驗室自行提取(原藥材由江蘇天陰制藥廠提供),成分為熟地黃12.0g、山藥0.6g、山萸肉2.5g、枸杞子12.0g、菟絲子0.6g、牛膝3.0g、白芍藥2.5g、甘草1.5g、珍珠母0.5g、黨參4.5g、制何首烏1.5g、肉蓯蓉3.0g、補骨脂1.5g、益智仁1.5g、丹參3.0g、全蝎粉0.5g、粉葛根3.0g、鹿角膠10.0g、龜版膠30.0g,按照既定工藝煮成湯藥,濃度為0.5g/ml的混懸液供灌胃用。6-羥基多巴胺(6-OHDA,美國Sigma公司,批號MKAA4439)。兔抗-Bax(批號:H0709)、兔抗-Bcl-2(批號:L0409)、DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。PBS(國藥集團化學試劑有限公司)。主要儀器:03-Y900-001型動物氧艙(煙臺宏遠氧業有限公司);LeicaRw2335輪轉切片機(德國);CX41奧林巴斯生物顯微鏡(德國);PMR+Q550病理圖像分析儀(德國)等。1.3學習方法1.3.1給藥、大鼠及美多升通過向大鼠右側中腦腹側被蓋區單點注射6-OHDA的方法成功建立偏側帕金森病大鼠模型,將制模成功的18只大鼠按照隨機數字表法隨機分為模型組、美多芭組及高壓氧聯合抗震顆粒組各6只。模型組每鼠給予生理鹽水2ml·100g-1·d-1灌胃;美多芭組每鼠給予美多芭10mg·kg-1·d-1灌胃;HBO聯合抗震顆粒組每鼠灌胃抗震顆粒10.0g生藥·kg-1·d-1,同時給予高壓氧治療:動物進艙,先用純氧洗艙10min,按100kPa/min速率加壓至0.25MPa,在高壓下停留60min,動物吸艙內氧氣,然后以10min勻速減壓至常壓,動物出艙,讓其自由攝食、飲水。3組均1次/d,共治療14d。1.3.2免疫組織化學法檢測石蠟切片的制備取各組大鼠深度麻醉后仰臥固定,快速開胸暴露心臟,直視下將穿刺針經左心室刺入升主動脈,先用37℃生理鹽水250ml快速沖洗,再灌注4%PBS(0.1mmol,pH7.4)250ml,先快后慢,全灌注時間1h;然后開顱分離出黑質置于4%PBS液中固定、脫水、石蠟包埋備用。將石蠟包塊進行超薄切片,參照免疫組織化學法分別進行Bcl-2和Bax染色:石蠟切片常規脫蠟水化;后根據每一種抗體的要求,對組織抗原進行相應修復;加入過氧化酶阻斷溶液(過氧化氫∶甲醇=1∶9)室溫下孵育15min,以阻斷內源性過氧化物酶的活性,PBS液沖洗3次;除去PBS液,正常非免疫動物血清封閉10min;除去血清,滴加第一抗體,室溫下孵育2～4h,PBS液沖洗3次;除去PBS液,滴加第二抗體,室溫下孵育10min,PBS液沖洗3次;除去PBS液,然后滴加新鮮配制的DAB溶液,顯色3～5min;自來水沖洗,蘇木素復染,再用自來水沖洗返藍;最后自然干燥,中性樹脂封片,鏡下觀察切片。免疫組化染色Bcl-2和Bax陽性信號為棕黃色或棕褐色,陽性表達定位于細胞質,細胞核藍染不表達,采用半定量計數法在病理圖像分析儀下觀察各張玻片,在每張玻片上,分別隨機選擇10個區域,每個區域計數100個細胞,然后加在一起統計出每千個黑質細胞中Bcl-2和Bax凋亡蛋白陽性表達的細胞數,即黑質Bcl-2、Bax陽性神經元的細胞千分率(‰)。1.4統計方法采用SPSS13.0統計軟件進行統計。計量資料以x±s表示,多組均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1高壓氧聯合抗震顆粒及美多升級蛋白表達水平對bcl-2表達的影響治療后各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義(P均<0.05),高壓氧聯合抗震顆粒組及美多芭組Bcl-2蛋白陽性表達率明顯高于模型組(P<0.05),Bax蛋白陽性表達明顯低于模型組(P<0.05),見表1。2.2異常行為改善高壓氧聯合抗震顆粒組帕金森病大鼠震顫、頭偏斜、行動遲緩、易激惹、尾僵直等異常行為有不同程度改善。美多芭組大鼠震顫、豎毛、嗅探、易激惹等異常行為亦有不同程度改善。3補瀉蝦、養肝藥成分及作用機制帕金森病是常見的神經系統退行性疾病之一,主要發生于中老年人,40歲前發病十分少見。病因仍不完全清楚,可能與遺傳、氧化應激和線粒體功能缺陷、環境因素、興奮性毒性作用、免疫因素及細胞凋亡等有關。目前,左旋多巴制劑仍然是公認的治療帕金森病最基本、最有效的一線藥物,具有起效快、減輕癥狀明顯等優點。我們研究所用之美多芭為復方制劑,每片含左旋多巴200mg、鹽酸卞絲肼50mg(以卞絲肼計)。左旋多巴為體內合成去甲腎上腺素、多巴胺的前體,卞絲肼為外周多巴脫羥酶抑制劑。左旋多巴與卞絲肼按4∶1配伍為美多芭應用,可減少左旋多巴的用量,增強其療效并減少其外周不良反應。帕金森病屬于中醫學顫證、震顫等范疇。肝腎陰虛、氣血不足是帕金森病發病的最根本原因,氣滯血瘀、痰熱動風是帕金森病發病的重要因素,針對這一病機特點,故認為滋腎平肝,活血化瘀,滌痰散結三法綜合運用應該是其治療法則。抗震顆粒便是以此原則組方,由補肝腎的經典代表方左歸丸加味組成,方中以熟地黃補腎益精、滋陰養血;山藥、黨參健脾益氣;珍珠母定驚止顫、養血舒筋;白芍滋肝陰;山萸肉、枸杞滋補肝腎;肉蓯蓉益腎填精;丹參活血通經;粉葛根疏通經絡;全蝎熄風祛瘀;龜版膠、鹿角膠合用,益精填髓等,共奏虛實并治,標本兼顧之功效。我們在實驗研究中發現,高壓氧聯合抗震顆粒能明顯抑制黑質神經元細胞凋亡,對帕金森病大鼠有保護性治療作用。高壓氧可能通過提高血氧分壓,氧彌散進入缺氧腦區的能力增強,使腦組織氧含量增加,有效改善腦組織的缺氧狀態,使變性的黑質和黑質紋狀體通路神經纖維功能得以恢復,從而使多巴胺的生成和運輸功能改善;興奮交感-腎上腺髓質系統,使腎上腺-多巴胺分泌增加,從而改善患者活動能力、步態,而且對面部表情、震顫有一定療效;高壓氧對自由基的清除作用已被證實,它可提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽的含量,加強清除自由基和抗氧化的能力,減輕自由基對腦組織的損害;增強線粒體三磷腺苷(ATP)酶活性,加速電子傳遞過程,使ATP產生增加,恢復大腦神經元的能量供應,增強血-腦脊液屏障通透性,加速抗震顆粒通過血腦屏障,提高抗震顆粒的生物活性,因此增強抗震顆粒的藥效等來達到治療帕金森病的目的。因此高壓氧聯合抗震顆粒在一定程度上能延緩黑質多巴胺神經元進行性蛻變及病情進展,改善其臨床癥狀。細胞凋亡是相對細胞壞死而言的另一種細胞死亡方式。細胞內存在兩種功能相反的與凋亡相關的基因:抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡基因(Bax、Bcl-XS等),它們之間的動態平衡保證著細胞的正常生長。Bcl-2/Bax比率的高低可能決定細胞趨向生存或死亡。Bcl-2基因編碼的Bcl-2是一種膜定位蛋白,具有抑制多種細胞發生凋亡的作用,其基因表達的增加有減少黑質多巴胺神經元凋亡的作用。Bax蛋白是黑質細胞凋亡的關鍵啟動因素,其增加就能增加黑質多巴胺神經元凋亡。本研究中高壓氧聯合抗震顆粒組及美多芭組Bcl-2陽性表達率明顯高于模型組(P<0.05),表明高壓氧聯合抗震顆粒及美多芭均能使Bcl-2表達增加,從而抑制黑質多巴胺神經元凋亡;兩組Bax陽性表達率明顯低于模型組(P<0.05),提示高壓氧聯合抗震顆粒及美多芭早期應用均能在一定程度上抑制帕金森病模型大鼠中腦黑質內Bax蛋白的表達,從而發揮抑制細胞凋亡的作用。高壓氧聯合抗震顆粒組與美多芭組Bcl-2及Bax陽性表達率比較差異均無統計學意義(P>0.05),說明高壓氧聯合抗震顆粒與美多芭均發揮抗凋亡治療作用。在研究中還發現,高壓氧聯合抗震顆粒組及美多芭組大鼠治療后震顫、活動遲緩、易激惹、豎毛、尾僵直等帕金森病異常行為均有不同程度的改善。盡管多數研究表明,應用左旋多巴制劑可能導致神經細胞凋亡,產生神經毒性,從而加速帕金森病的神經變性過程,長期使用,其藥效會降低,并且出現嚴重的副作用。但由于本研究的動物實驗中應用美多芭時間較短(14d),長