特芐康唑抗真菌的藥敏試驗

1903年，自赫維尼發現碘化鉀可以預防真菌絲菌病以來，人們在20世紀研究了不同的方法來解決真菌病。20世紀50年代兩性霉素B的發現是抗真菌藥物研究中的一大突破。60年代開始的對氮唑類化合物的研究,將抗真菌藥物研究推向了一個新階段,尤其是酮康唑、氟康唑和伊曲康唑的相繼問世,給真菌病患者帶來了福音。但是,在最近的20年中,隨著癌癥放療、化療和器官移植患者人數的增加,免疫抑制劑和廣譜抗生素的大量使用,以及愛滋病的廣泛流行,深部真菌感染率上升了40倍,深部真菌感染正日益成為一種常見病、多發病,并已成為引起這類疾病患者死亡的主要原因。患者由于免疫功能下降或喪失,其真菌病的發生率可高達正常人的1000倍。另外,真菌的耐藥性問題也越來越嚴重。目前臨床常用的抗真菌藥物由于在抗菌效果、不良反應及對付真菌耐藥性方面仍存在較多問題,因此,在即將來臨的21世紀,抗真菌藥物研究必將仍是極具挑戰性的課題。羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是真菌麥角甾醇生物合成通路中的關鍵酶,作用于該酶的酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等氮唑類藥物在臨床抗真菌治療中具有突出地位,因此,以CYP51為作用靶點的氮唑類化合物一直是抗真菌藥物研究的一大熱點。我們在模建白念珠菌CYP51酶三維結構分子模型和研究氮唑類藥物與該酶作用方式的基礎上,通過計算機輔助設計,合成了新的氮唑類化合物特芐康唑(terbiaminazole)(Fig.1)。本文參照1992年美國國家臨床試驗標準化委員會(NCCLS)提出的標準,分別建立了酵母和霉的微量液基稀釋藥敏試驗方法,測定了化合物特芐康唑對12種臨床常見真菌的體外抗菌活性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1病例選擇藥物鑒定ATCC標準株:白念珠菌(Candidaalbicans)ATCC76615及其氟康唑耐藥株2株、新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)ATCC32609分別由長征醫院菌種保存中心贈送。臨床株:近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、平滑念珠菌(Candidaglabrata)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)、裴氏著色真菌(Fonsecaeapedrosoi)、緊密著色真菌(Fonsecaeacompacta)、申克氏孢子絲菌(Sporothrixschenckii)、羊毛狀小孢子菌(Microsporumcanis)、石膏狀小孢子菌(Microsporumgypseum)、石膏狀毛癬菌(Trichophytomentagrophytes)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus),均由長海醫院真菌室提供,并經形態學和生化學鑒定。1.1.2培養基mopsRPMI1640培養液:RPMI1640(GibcoBRL)10g,NaHCO32.0g,嗎啡啉丙磺酸(morpholine-propanesulfonicacid,MOPS)(Sigma)34.5g(0.165mol/L),加三蒸水900ml溶解,1mol/LNaOH調pH至7.0(25℃),定容至1000ml,濾過消毒,4℃保存。沙堡葡萄糖瓊脂培養基(SDA):蛋白胨10g,葡萄糖40g,瓊脂18g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,調整pH至7.0,定容至1000ml,高壓滅菌后4℃保存。YEPD培養液:酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,定容至1000ml,高壓滅菌后4℃保存。1.1.3dmso和tx-84a特芐康唑和布替萘芬(butenafine)由本院藥物化學教研室提供,氟康唑(fluconazole)和酮康唑(ketoconazole)由本院有機化學教研室提供。DMSO為國產分析純,用前重蒸。隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠);THZ-82A臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫療器械廠);511型酶標分析儀(上海第三分析儀器廠)。1.2方法1.2.1篩選菌液中的霉菌取酵母于實驗前接種至1mlYEPD培養液,35℃,250r/min振蕩培養16h,活化2次,使之處于指數生長期后期,用血細胞計數板計數,以RPMI1640培養液調整菌液濃度至1×103～5×103個/ml。取霉于實驗前接種至SDA斜面,35℃,培養一周,活化2次,使菌落覆蓋SDA斜面,加適量RPMI1640培養液,用吸管吹打菌落,使霉孢子游離于RPMI1640培養液中,然后經四層無菌紗布過濾。培養液經血細胞計數板計數后,加RPMI1640培養液調整孢子濃度至1×103～5×103個/ml。1.2.2藥物貯存液制備受試藥物分別用DMSO配成6.4g/L溶液,-20℃保存,實驗前,將6.4g/L藥物貯存液取出置35℃溫箱融化,用RPMI1640培養液稀釋10倍,充分混勻,使成640mg/L,備用。1.2.3表面活性劑的檢測取無菌96孔板,于每排1號孔加RPMI1640100μl作空白對照;3～12號孔各加新鮮配制的菌液100μl;2號孔分別加菌液190μl和受試化合物溶液10μl。2～11號孔10級倍比稀釋,使各孔的最終藥物濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/L,各孔中DMSO含量均不超過0.5%;12號孔不含藥物,作陽性對照。各藥敏板于35℃培養。1.2.4mic80值的測定念珠菌、新生隱球菌及霉分別于35℃培養24、72h和1周后,用酶標分析儀于620nm測各孔OD值。與陽性對照孔比,以OD值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC80(真菌生長80%被抑制時的藥物濃度)。當藥物的MIC80值超過測定濃度范圍時,按以下方法進行統計:MIC80值高于最高濃度32mg/L時,計為“>32mg/L”;MIC80值為最低濃度或在最低濃度以下時,不作區別,均計為“≤0.0625mg/L”。上述實驗均平行操作2到3次,當MIC80值能準確重復或只差一個濃度時才被接受,并以較高濃度作為MIC80值;當MIC80值相差兩個濃度以上時,則需重新實驗,直到符合要求為止。2結果2.1微量液基初始濃度對藥物mic80值的影響取白念珠菌ATCC76615及其2株耐藥菌,于YEPD培養液中兩次活化后,均用RPMI1640稀釋成1×103個/ml和1×104個/ml兩個濃度,分別測定特芐康唑、氟康唑和酮康唑在不同濃度菌液中的MIC80值,考察在微量液基稀釋藥敏實驗中,菌液起始濃度對藥物MIC80的影響(Tab.1)。實驗結果證明,在1×103～1×104個/ml濃度范圍內,菌液起始濃度的改變沒有顯著影響藥物對各菌的MIC80值。2.2培養時間對藥物mic80值的影響取3株白念珠菌和2株新生隱球菌,在藥物作用不同時間后,測定各MIC80值,考察藥敏板的培養時間對實驗所得MIC80值的影響程度。對于新生隱球菌,在培養時間增加24h后,各藥物的MIC80值均增加一個濃度,而培養時間增至1周時,各MIC80值分別提高4～16倍(Tab.2)。對于白念珠菌,培養時間對實驗所得MIC80值的影響更大,當培養時間增加24h時,各藥物對白念珠菌的MIC80值分別增加2～128倍(Tab.3)。因此,在實驗中應嚴格控制藥敏板的培養時間,準時進行結果測定,以便得到準確的實驗結果。2.3菌株體外抗菌活性本實驗分別建立了酵母和霉的微量液基稀釋藥敏實驗方法,并以氟康唑、酮康唑和布替萘芬為對照,考察了新化合物特芐康唑對包括深部真菌、淺表真菌和皮下組織真菌在內的12種臨床常見真菌的體外抗菌活性,各菌株對化合物的敏感性用MIC80表示(Tab.4)。結果顯示,除煙曲霉外,特芐康唑對其他11種真菌的MIC80均在4mg/L以下,尤其對酵母,除耐藥株,其MIC80值基本上在0.125mg/L以下,顯示出卓越的體外抗真菌活性。2.4聯合抑菌效果取藥敏實驗中的藥物溶液等量混勻,作為聯合用藥的原始藥液制備藥敏板,使各單一成分的終濃度均為16～0.031mg/L,分別用微量液基稀釋法考察特芐康唑和氟康唑與布替萘芬的聯合抑菌效果。特芐康唑與布替萘芬合用,可降低各自的MIC值,尤其對新生隱球菌的抗菌活性大大增加(Tab.5)。3霉藥敏實驗方法的應用近年來,由于新的條件致病性真菌感染不斷出現,真菌耐藥菌株不斷增多,抗真菌藥物研究越來越成為人們研究的熱點,與此同時,抗真菌藥物的敏感性實驗也越來越受到人們的重視。建立一個準確可靠,重現性好,且簡便易行的抗真菌藥物敏感實驗方法,對于準確快速地測定新化合物的抗真菌活性,指導抗真菌新藥的設計和合成具有重要意義,而且,臨床對真菌病的成功治療,也有賴于準確快速地測定感染菌株對現有抗真菌藥的敏感性。美國國家臨床試驗標準化委員會(NCCLS)于1992年提出了對兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、酮康唑和氟康唑的藥敏實驗方案,即酵母的液基稀釋抗真菌藥物敏感實驗參考方案。該方案公布后,被多個實驗室采用,得到了令人滿意的可重復性結果。但是對于霉,目前還沒有建立一個標準的藥物敏感實驗方案。由于原本罕見的曲霉病在愛滋病患者中的發病率越來越高;生活質量的提高也使人們對以前未被重視的頑固的皮癬病治療提出了新要求,研究對霉有特效的抗真菌藥物和建立標準的抗真菌藥物敏感實驗方法,已成為當前抗真菌藥物研究中一個突出而需急待解決的問題。Oh等曾用生物細胞生長跟蹤裝置檢測曲霉菌絲的生長速度并測定兩性霉素B對曲霉的抗真菌活性,但未能得到普及。本實驗參照NCCLS方案,在建立酵母藥敏實驗方法的同時,還建立了霉的微量液基稀釋藥物敏感實驗方法。進行霉藥敏實驗,關鍵在孢子溶液的制備。Pujol等提出,用玻棒將霉刮下,經強烈渦旋制成混懸液,再用RPMI1640配成需要的濃度。我們發現,該法容易使菌液中混入菌絲和培養基,影響實驗結果。我們直接用RPMI1640培養液適度沖洗霉的菌落,并用四層無菌紗布過濾,所得孢子溶液雖然濃度較低,但無菌絲、培養基等雜質干擾。用該法制備的孢子溶液稍作濃度調整后便可直接用于藥敏實驗,所得實驗結果穩定,重現性好。霉藥敏實驗方法的建立為客觀、全面考察化合物對酵母和霉、深部和淺表真菌的抗真菌活性創造了條件。我們選擇臨床較常見的12種真菌:包括5種深部真菌(新生隱球菌、白念珠菌、熱帶念珠菌、平滑念珠菌和近平滑念珠菌),3種淺表真菌(石膏狀毛癬菌、石膏狀小孢子菌和羊毛狀小孢子菌),3種皮下組織真菌(裴氏著色真菌、緊密著色真菌和申克氏孢子絲菌),另外還有煙曲霉,用于全面考察新化合物的體外抗真菌活性。在藥敏實驗過程中,還存在著許多影響因素。其中,培養基的選擇是影響MIC值的重要因素之一。Pfaller等研究證實,RPMI1640培養液可產生較穩定的藥敏實驗結果。國內也有報道,用RPMI1640培養液可使氟康唑的體外抗真菌活性與臨床療效相吻合,提示氟康唑的體內外抗真菌活性表現不一致可能與使用傳統的沙堡培養液進行藥敏實驗有關。因此,本實驗也采用了NCCLS推薦的RPMI1640培養液。實驗中我們發現,在1×103～1×104個/ml范圍內,菌液起始濃度的改變并不影響藥物的MIC值,這使藥敏實驗變得容易操作,不必再為實驗前精確測定菌液濃度而費周折。但藥敏板培養時間的長短會影響藥物的MIC值。由于新生隱球菌的繁殖速度相對較慢,當培養時間延長24h時,對藥物的MIC值影響不大,但對于白念珠菌,如果培養時間延長24h,藥物的MIC值就會急劇升高,將嚴重影響測試結果。可見,為了保證實驗的準確性和可重復性,嚴格控制藥敏板培養時間,準時進行結果測定是很有必要的。本文以氟康唑、酮康唑和布替萘芬為對照,用微量液基稀釋法測定了氮唑類新化合物特芐康唑對上述12種臨床常見真菌的MIC80值,較全面地考察了特芐康唑的體外抗真菌活性和作用特點。特芐康唑除對煙曲霉作用稍差(MIC80=16mg/L),對其他霉的MIC80值在0.25～4mg/L之間,作用強于氟康唑,對酵母,其MIC80值更普遍低于0.125mg/L,活性達氟康唑的8～256倍。考慮到氟康唑的體外抗真菌活性較差,與其高效的體內活性不一致,實驗中又設了酮康唑對照組,實驗結果表明,特芐康唑對各種真菌的體外抗真菌活性與酮康唑相當。上述實驗結果證明特芐康唑在體外具有廣譜、高效