第十三章

DNA生物合成第十三章DNA生物合成內容提要DNA的半保留復制依賴RNA的DNA合成DNA損傷與修復內容提要DNA的半保留復制2.1修復機制1.光復活TT紫外線(260nm)T(胸腺嘧啶）二聚體雙鍵打開2.1修復機制1.光復活TT紫外線(260nm)T(胸腺嘧紫外光T-T二聚體可見光激活該酶只有高等哺乳動物該功能退化掉了。例對細菌紫外誘變或殺滅時盡量保持暗環境。光復活酶結合于損傷部位紫外光T-T二聚體可見光激活該酶只有高等哺乳動物該功能退化掉2.切除修復核酸酶DNA聚合酶DNA連接酶屬于復制前的修復。2.切除修復核酸酶DNA聚合酶DNA連接酶屬于復制前的修復。3.重組修復復制同時的修復*復制DNA聚合酶、連接酶補缺提問：原損傷部位沒有修復，對后代影響大嗎？在后代中只有一個個體含有該條DNA，后代越多，影響比例越小，等于消除影響。3.重組修復復制同時的修復*復制DNA聚合酶、連接酶補缺提問****4.SOS修復SOS—求救信號DNA損傷嚴重，復制受到抑制，前幾種方法難以奏效時：誘導校對能力差的DNA聚合酶形成，局部“亂配”********進化、變種、癌癥、誘變育種等等都是基于這一機理。為了生存——變。****4.SOS修復SOS—求救信號誘導校對能力差的DNA第一節DNA的半保留復制DNA半保留復制的理論參與DNA復制的酶復制的起點和方式復制過程第一節DNA的半保留復制DNA半保留復制的理論一、DNA半保留復制的理論半保留復制的實驗依據和意義雙向復制復制的半不連續性一、DNA半保留復制的理論半保留復制的實驗依據和意義（一）半保留復制的實驗依據和意義半保留復制的實驗依據半保留復制的概念半保留復制的意義復制的半不連續性（一）半保留復制的實驗依據和意義半保留復制的實驗依據1.半保留復制的實驗依據1958年，Meselson證明：用，15NH4Cl唯一氮源培養大腸桿菌，之后，用14NH4Cl培養，然后進行CsCl2進行密度梯度離心。由于15NH4Cl密度大于14NH4Cl，因此，形成不同區帶，經過若干代培養后，兩個NH4Cl區帶增多。1.半保留復制的實驗依據1958年，Meselson證明第十三章DNA生物合成課件2.半保留復制的概念DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。2.半保留復制的概念DNA生物合成時，母鏈DNA解開為3.半保留復制的意義按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩定性的分子基礎，但不是絕對的。3.半保留復制的意義按半保留復制方式，子代DNA與親代（二）雙向復制原核生物的DNA雙向復制真核生物的DNA雙向復制（二）雙向復制原核生物的DNA雙向復制1.原核生物的DNA雙向復制原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。復制起始點（ori）：DNA復制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復制起始點復制中的放射自顯影圖象1.原核生物的DNA雙向復制原核生物復制時，DNA從A.環狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)oriterABCA.環狀雙鏈DNA及復制起始點oriterA第十三章DNA生物合成課件2.真核生物的DNA雙向復制真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功能單位。2.真核生物的DNA雙向復制真核生物每個染色體有多個起5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’3.復制的半不連續性順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續進行的，這股鏈稱為領頭鏈（先導鏈）。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續延長，這股不連續復制的鏈稱為隨從鏈（滯后鏈）。復制中的不連續片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領頭鏈連續復制而隨從鏈不連續復制，就是復制的半不連續性。3.復制的半不連續性順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續進行3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領頭鏈（先導鏈）(leadingstrand)隨從鏈（滯后鏈）(laggingstrand)3535解鏈方向3′5′3′3′5′領頭鏈（先導鏈）二、參與DNA復制的酶DNA聚合反應DNA聚合酶DNA連接酶DNA解旋相關酶類引物酶(Primase)和引發體二、參與DNA復制的酶DNA聚合反應參與DNA復制的物質底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質因子參與DNA復制的物質底物(substrate):d（一）DNA聚合反應聚合反應方程式聚合反應的特點（一）DNA聚合反應聚合反應方程式1.聚合反應方程式n1dATPn2dCTPn3dGTPn4dTTPDNA聚合酶DNA模板DNA+（n1+n2+n3+n4)PPiPPi隨即被焦磷酸酶水解，從而推動聚合反應的進行。(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

1.聚合反應方程式n1dATPn2dCTPn3dGT第十三章DNA生物合成課件2.聚合反應的特點以四種脫氧核苷三磷酸為底物；DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3

方向進行；產物DNA的性質與模板相同。反應需Mg++激活。2.聚合反應的特點以四種脫氧核苷三磷酸為底物；（二）DNA聚合酶原核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶（二）DNA聚合酶原核生物的DNA聚合酶1.原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA-polIVDNA-polV1.原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ1)大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的分子統計數5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉化率主要功能活性（nt/minDNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復合物）109，000400+++1校讀,修復1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50復制100000特性不清填補缺口501)大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA分子量DNADNA聚合5'

ucgagcuag-OH3'

5'

ucgagcuagDNApoldNTP2)5′

3′聚合作用3'

agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc5'3'

agctcgatcgtagcctagcgtagcagtgcacgatc5'catcggatcgcatcgtcacgtgctag3'5'ucgagcuag-OH3'5'ucgagc5’3’內切酶外切酶3)外切酶與內切酶作用圖解5′

3′外切酶活性的功能切除引物，切除突變片段5’3’5’3’內切酶外切酶3)外切酶與內切酶作用圖解5′3′外切4)3’

5’

外切酶活性

校讀

錯配堿基4)3’5’外切酶活性校讀錯配堿基小片段

大片段（Klenowfragment）5'→3'聚合功能3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性5)DNApolI小片段大片段5'→3'聚合功能5'→3'功能：是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ：由十種亞基組成，其中α亞基具有5’→3’聚合DNA的酶活性，因而具有復制DNA的功能；而ε亞基具有3’→5’外切酶的活性，因而與DNA復制的校正功能有關。(250kD)6)DNA-polⅢ功能：是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。DNA-po2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol:起始引發，有引物酶活性。DNA-pol:參與低保真度的復制。DNA-pol:線粒體DNA復制中起催化作用。DNA-pol:延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol:復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol:起始引發，在真核生物中，目前發現的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，參與染色體DNA復制的是polα（延長隨從鏈）和polδ（延長領頭鏈），參與線粒體DNA復制的是polγ，polε與DNA損傷修復、校讀和填補缺口有關，polβ只在其他聚合酶無活性時才發揮作用。

在真核生物中，目前發現的DNA聚合酶有五種，分別命名為真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶3.DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)作用方式DNA連接酶催化的條件功能3.DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)1)DNA連接酶(DNAligase)作用方式連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。1)DNA連接酶(DNAligase)作用方式連接DHO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’2)DNA連接酶催化的條件DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3’-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。2)DNA連接酶催化的條件DNA連接酶催化的條件是：①3)功能DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。3)功能DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。4.DNA解旋相關酶類解旋酶(helicase)拓撲異構酶（topoisomeraseI、II）單鏈DNA結合蛋白(SSB)4.DNA解旋相關酶類解旋酶(helicase)解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結合蛋白解螺旋酶dnaA、B、C…DnaA、B、C…ATP1)解旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈解螺旋酶dnaA、B、C…DnaA、B、C…ATP1)解旋酶拓撲(topology)與拓撲異構DNA正超螺旋與負超螺旋負超螺旋正超螺旋DNA雙螺旋拓撲異構酶超螺旋螺旋2)拓撲異構酶（Topo）拓撲(topology)與拓撲異構DNA正超螺旋與負超螺旋負拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變為松弛狀態。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態。作用機制

拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結Topo酶：切割DNA鏈，使其松弛后再連接HelicaseTopoⅡ（DNAGyrase）Topo酶：切割DNA鏈，使其松弛后再連接HelicaHelicaseSupercoiledDNATOPOⅡHelicaseSupercoiledDNATOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡTOPOⅡATPTOPOⅡATPTOPOⅡTOPOⅡ3)單鏈DNA結合蛋白（SSB）作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止單鏈DNA被核酸酶水解SSB3)單鏈DNA結合蛋白（SSB）作用：防止單鏈DNA5.引物酶(Primase)和引發體引物酶(primase)DNA合成需在RNA引物的基礎上進行，復制起始時催化生成RNA引物的酶引發體(primosome)由引發前體與引物酶（primase）組裝而成。5.引物酶(Primase)和引發體引物酶(primase)DnaA引發體（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA復制的起始區域5′3′3′5′引物酶DnaC引發體解螺旋酶DnaA引發體（primosome）：包括解螺旋酶、Dna

小結主要成員

主要作用DnaA識別復制起始位點解螺旋酶解開DNA雙鏈SSB維持已解開單鏈DNA的穩定引物酶合成RNA引物TOPO使打結、纏繞、正超螺旋的DNA松馳DNA-polⅢDNA復制DNA-polⅠ水解引物、填補空隙、修復作用DNA連接酶催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接小結主三、復制的起點和方式復制起點復制方向復制方式三、復制的起點和方式復制起點（一）復制起點復制起點（origin,ori或o,復制原點）復制開始處:DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單復制起點即－－整個染色體只有一個復制單位（一）復制起點復制起點（origin,ori或o,復制

真核生物（Eukaryote）:多復制起點即－－一個genome中有多個復制單位真核生物（Eukaryote）:多復制起

（1）單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉

單向復制

雙向復制（二）復制方向（復制過程的順序性）（1）單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉第十三章DNA生物合成課件（2）復制的多模式

單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向（原核）多起點、雙方向（真核）（2）復制的多模式單起點、單方向多起點、單方向單起點、雙（三）復制方式大多數以對稱方式進行－－即兩條鏈同時復制也有一定時期內DNA只復制一條鏈的情況

（1）θ

復制或從新起始（denovoinitiation）或復制叉式（replicationfork）雙鏈環狀DNA的復制眼可以形成一種θ

結構，形狀像希臘字母θ，因而叫….（三）復制方式大多數以對稱方式進行－－即兩條鏈同時復制（1

單、雙向θ

復制模式圖單向復制雙向復制單、雙向θ復制模式圖單向復制雙向復制

（2）D環復制（Displacementform

）又稱置換式

線粒體和葉綠體

DNA的復制方式（2）D環復制（Displacement（3）σ復制或滾環式復制（rollingcirclereplication）或共價延伸方式（covalenceelongation）由于復制時產生的滾環結構形狀象σ，稱σ復制

病毒、細菌因子，如含有單鏈環狀DNA的φX174、G4、M13（3）σ復制或滾環式復制（rollingcircle第十三章DNA生物合成課件第十三章DNA生物合成課件(4)線性DNA雙鏈的復制單一起點、單向，如：腺病毒單一起點、雙向，如：T7噬菌體多個起點、雙向(4)線性DNA雙鏈的復制四、復制過程原核細胞DNA的復制合成真核細胞DNA的復制合成四、復制過程原核細胞DNA的復制合成1.旋轉酶解開超螺旋。旋轉酶（一）原核細胞DNA的復制合成1.旋轉酶解開超螺旋。旋轉酶（一）原核細胞DNA的復制合成2.解螺旋酶在起點雙向打開螺旋復制起始處的DNA片段起點復制叉解螺旋酶——解開雙鏈2.解螺旋酶在起點雙向打開螺旋復制起始處的DNA片段起點復制解螺旋酶3.DNA結合蛋白與單鏈結合并向前移動DNA結合蛋白起點提問：DNA結合蛋白的作用？ATGC防止單鏈復合解螺旋酶3.DNA結合蛋白與單鏈結合并向前移動DNA結合蛋白起點ATCCATT小段RNA引物U磷酸核糖RNA聚合酶4.RNA聚合酶催化起點處通過堿基互補連接引物RNA鏈。作用——確定起始部位，引導復制開始。3`OH5`PiPiPi3`OH5`PiPiPi3`OH5`PiPiPiA—U

G—C起點ATCCATT小段RNA引物U磷酸核糖RNA聚合酶4.R6.新鏈5`→3`延長（復制DNA）5.引物3`連接dXTP6.新鏈5`→3`延長（復制DNA）5.引物3`連接dXTPE.COLi的DNA聚合酶

功能ⅠⅡⅢ5’→3’聚合作用+++5’→3’外切酴作用+－－3’→5’外切酶作用+++聚合核苷酸數/min600309000分子數/細胞40010010*DNApolⅢ主要負貢DNA鏈延伸。E.COLi的DNA聚合酶功能開鏈方向起點新鏈5｀新鏈3｀新鏈3｀新鏈5｀

？

？父代DNA—兩鏈方向相反

！必然無法連續復制開鏈方向開鏈方向起點新鏈5｀新鏈3｀新鏈3｀新鏈5｀？？父代DN7.均以5｀→3｀方向形成前導鏈和滯后鏈由岡崎片段連接成的新DNA鏈稱滯后鏈。與復制叉移動方向相同，可以一直復制到底的新DNA鏈稱前導鏈。7.均以5｀→3｀方向形成前導鏈和滯后鏈由岡崎片段連接成的新5`3`5`8.切除引物，補缺。3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`3`DNA聚合酶3`→5`核酸外切連接酶連接酶連接缺口切除引物、切除配錯dXTP新鏈5`3`5`8.切除引物，補缺。3`3`3`5`5`3`5`3`3`5`5`3`5`3`前導鏈連續復制滯后鏈不連續復制DNA復制為5`→3`半不連續復制。前導鏈連續復制滯后鏈不連續復制DNA復制為5`→3`半不連續半保留——復制結果半不連續——復制過程半保留——復制結果（二）真核細胞DNA的復制：

（DNA指導的DNA合成）真核生物與原核類似，但更復雜，不同之處：1.DNA模板上有多個起點，即真核細胞DNA復制由多個復制子共同完成。（二）真核細胞DNA的復制：

（DNA指導的D2.有5種DNA聚合酶，

各具功能：復制DNA：

α→后滯鏈；

δ→前導鏈；修復DNA：β、ε；復制線粒體DNA：γ；引物合成：α。2.有5種DNA聚合酶，

第二節RNA指導的DNA合成反轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，也稱逆轉錄。這是DNA生物合成的一種特殊方式。

第二節RNA指導的DNA合成反轉錄是以RNA為模板合成反轉錄酶都具有多種酶活性①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要R