改進(jìn)das-elisa法檢測馬鈴薯病毒

貴州省是中國的一個省，也是中國第一個種植水稻的省份之一。目前，它是貴州省重要的糧食、飼料、蔬菜、原料和耕作種類和作物。2000年貴州馬鈴薯種植面積超過小麥,成為全省居水稻、玉米之后的第三大主要農(nóng)作物,2004年種植面積達(dá)55.13萬hm2,居全國第一,平均單產(chǎn)860kg/667m2,2005年種植面積達(dá)57.49萬hm2,平均單產(chǎn)850kg/667m2。馬鈴薯已成為貴州名副其實(shí)的強(qiáng)勢產(chǎn)業(yè)。但長期以來眾多的馬鈴薯品種因病毒侵染急劇減產(chǎn)、品種退化,喪失了繼續(xù)利用價值,縮短了品種的利用時間,使育種工作常常處于落后于生產(chǎn)需要的被動局面。品種的頻繁更替,又使病毒侵染復(fù)雜化,進(jìn)一步加速了品種的退化。因此,采用組織培養(yǎng)法建立馬鈴薯脫毒種薯繁育體系是阻止病毒侵染、提高產(chǎn)量、發(fā)揮優(yōu)良品種特性的有效途徑,其中實(shí)現(xiàn)組培苗的全面脫毒是這一體系的中心環(huán)節(jié),高效可靠的病毒檢測手段則是確保種苗脫毒的前提和關(guān)鍵。在馬鈴薯生產(chǎn)中,病毒檢測是保證各級種薯質(zhì)量的關(guān)鍵;從原種中徹底汰除主要馬鈴薯病毒,控制其再侵染,建立種薯分級與檢驗(yàn)制度是提高種薯質(zhì)量的手段和重要保證。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DAS-ELISA)法是鑒定馬鈴薯病毒的常規(guī)方法。本試驗(yàn)對常規(guī)DAS-ELISA法主要作了以下兩個方面的改進(jìn):(1)在包被抗體和酶標(biāo)記這兩步,由原來在一塊板上一種酶標(biāo)記一種抗體改為同一塊板上同時標(biāo)記對應(yīng)PVX、PVY、PVS、PLRV4種病毒的抗體,從而成倍地節(jié)省了工作量和時間;(2)使DAS-ELISA每一步反應(yīng)均在恒溫?fù)u床中進(jìn)行,進(jìn)而加快了反應(yīng)速度,節(jié)省了反應(yīng)時間,很適合大量樣品的快速檢測。改進(jìn)DAS-EILSA法的建立,為更多、更快地提供高質(zhì)量的種薯,為資源開發(fā)利用和科研工作提供更多的健康材料,提高鑒定馬鈴薯病毒的速度和精確度是至關(guān)重要的。1材料和方法1.1材料表面1.1.1甘薯試驗(yàn)幼苗和腫瘤8個品種20管馬鈴薯的試管苗,大西洋、費(fèi)烏瑞它的馬鈴薯塊莖共66粒塊莖采自田間收獲的薯塊,由貴州省馬鈴薯研究所研究室提供。1.1.2馬鈴薯y、馬鈴薯s以及馬鈴薯卷葉病毒標(biāo)準(zhǔn)毒源(陽性對照),健康對照,馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)。抗血清及其相應(yīng)的酶標(biāo)抗體均由在美國阿格迪(agdia)公司購買,生化試劑均為分析純。1.2方法1.2.1酶標(biāo)抗體的確定用pH9.6碳酸鹽緩沖液倍比系列稀釋各病毒抗體,稀釋倍數(shù)為1∶100~800,用PBS-Tween202%PVP緩沖液倍比系列稀釋各病毒酶標(biāo)抗體,稀釋倍數(shù)為1∶100~800,感病植株和健康植株在提取緩沖液中稀釋10倍,按常規(guī)DAS-ELISA法操作程序進(jìn)行方陣滴定,選擇最適稀釋度,結(jié)果得出包被抗體的最適稀度為1∶300,酶標(biāo)抗體最適稀度為1∶400,這種組合下檢測效果最好。1.2.2檢測馬鈴薯抗氧化能力操作步驟:(1)用pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被PVX、PVY、PVS、PLRV4種病毒抗體,然后每種病毒抗體每孔100μL包被一塊微量滴定板,將4塊滴定板4℃過液或37℃孵育3~4h,PBST-ween-20溶液沖洗3次,每次3min。(2)用PBS-Tween202%PVP溶液稀釋抗原(馬鈴薯汁液),將每份抗原分別滴加4塊滴定板,每孔100μL,4℃過液或37℃孵育4h,洗板同上。(3)用PBS-Tween202%PVP酶標(biāo)緩沖液分別稀釋PVX、PVY、PVS、PLRV4種病毒酶標(biāo)抗體,每孔100μL對應(yīng)加入5塊滴定板,4℃過液或37℃孵育4h,洗板同上。(4)4塊滴定板分別滴加底物溶液,每孔100μL,室溫放置,觀察反應(yīng)。以上各反應(yīng)均在靜置狀態(tài)下進(jìn)行。1.2.3pb-tween202%pv抑制劑緩沖液4操作步驟:(1)用pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被PVX、PVY、PVS、PLRV4種病毒抗體,然后每種病毒抗體每孔150μL包被一塊微量滴定板,用粘性膠帶密封滴定板恒溫振搖狀態(tài)下37℃孵育30min,用PBS-Tween20洗滌緩沖液洗滌3次,每次3min。(2)用PBS-Tween202%PVP溶液稀釋抗原(馬鈴薯汁液),將每份抗原分別滴加4塊滴定板,每孔180μL,用粘性膠帶密封后37℃恒溫振搖孵育30min,洗板同上。(3)向PBS-Tween202%PVP酶標(biāo)緩沖液中溶解2%白蛋白,稀釋PVX、PVY、PVS、PLRV4種病毒酶標(biāo)抗體,輕輕混勻,每孔160μL加入滴定板,密封后恒溫振搖,37℃孵育30min,如前述洗板。將底物溶液每孔160μL加入滴定板,室溫放置,觀察反應(yīng)。1.3帶毒情況判斷在加入底物溶液30~60min,根據(jù)聚乙烯微量滴定板中樣品孔顏色變化判定帶毒情況,顯黃色判為陽性,微黃色或不顯色判為陰性,判該樣品未感染待測病毒,為合格樣品。2改進(jìn)das-elisa法用兩種方法對馬鈴薯試管苗進(jìn)行病毒檢測,常規(guī)DAS-ELISA和局部改進(jìn)的DAS-ELlSA法其檢測結(jié)果一致,即陽性率一致。利用酶標(biāo)儀對檢測結(jié)果進(jìn)行讀數(shù)判定,其結(jié)果與目測結(jié)果一致,兩種方法靈敏度一致。所檢測樣品成陰性為合格樣品,1個以上檢測樣品為陽性則屬不合格樣品。改進(jìn)的DAS-ELISA將常規(guī)DAS-ELISA中包被和制樣兩步合成一步,大大縮短了時間,由原來所需的3~5h包被和加上樣品后過夜孵育約14h縮短為3h,使本來進(jìn)行一次DAS-ELISA1.5d的工作在1d內(nèi)便可輕松完成。因此,在操作時間和耗材等方面,快速法比常規(guī)法優(yōu)越得多。在改進(jìn)DAS-ELISA法中,在包被、加樣和加酶標(biāo)時,將原來各步加樣量一樣改為逐級遞減,特別是在第二步加酶標(biāo)抗體時,低于第一步的上樣量,避免了酶標(biāo)抗體與未包被區(qū)域的接觸,減少了非特異性吸附,避免了假陽性的產(chǎn)生,靈敏度相應(yīng)略低于快速法。改進(jìn)DAS-ELISA法整個反應(yīng)都是在恒溫振搖狀態(tài)下進(jìn)行,這可以提高抗體與固相載體、抗原與抗體和抗原與酶標(biāo)等分子之間的碰撞機(jī)率,加快反應(yīng)速度,比靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行各反應(yīng)的常規(guī)法大大縮短了檢測時間。3das-elisa實(shí)驗(yàn)過程中的誤操作帶來的誤操作帶來的問題DAS-ELISA是看似簡單而實(shí)際操作起來并不十分簡單的實(shí)驗(yàn)技術(shù),在進(jìn)行DAS-ELISA的具體實(shí)驗(yàn)過程中,往往會出現(xiàn)失誤,現(xiàn)將進(jìn)行DAS-ELISA應(yīng)注意的問題總結(jié)如下:3.1酸度的測定pH值是影響檢測結(jié)果的重要因素,由于各地條件不同,所使用的蒸餾水或去離子水的酸堿度也會有所差異,因此配制出溶液的酸堿度也不盡相同,有時會相差很大,特別是在配制包被緩沖液和底物緩沖液時,最好用去離子水,并用酸度計(jì)調(diào)pH值。包被緩沖液的pH值以9.6為宜,底物緩沖液的pH值以9.8為宜。這兩種緩沖液的偏酸或偏堿將直接影響包被和顯色。3.2抗抗體與包被液乳液的最佳添加量加樣量逐級遞減可以有效避免一些人為操作造成的假陽性,包被時加樣量最多,以使每個孔充分的較大范圍的包被,加酶標(biāo)抗體應(yīng)低于包被時加樣量至少20μL,這樣酶標(biāo)抗體液的液面就可低于包被液液面約0.1mm,只要酶標(biāo)板傾斜度不超過20°時,酶標(biāo)抗體液的液面就不會高于包被液液面,若加量與包被時加樣量一樣多,因酶標(biāo)抗體與抗體一樣可以與酶標(biāo)板吸附,將極有可能因人為操作而使酶標(biāo)抗體吸附到未被包被區(qū)域,造成假陽性。滴加底物液同樣遵循上述遞減原則,使底物僅與酶標(biāo)抗體2病毒粒子復(fù)合體上標(biāo)記酶發(fā)生酶促反應(yīng),逐級遞減可以最大限量降低人為操作帶來的假陽性。3.3elisa檢測結(jié)果洗板是否徹底與檢測結(jié)果中背景顏色的有無和深淺密切相關(guān)。在進(jìn)行DAS-ELISA過程中,涉及到多次洗滌酶標(biāo)板,以洗去未結(jié)合的抗體、病毒和酶標(biāo)抗體,以便得到準(zhǔn)確