大蒜超氧化物歧化酶分離純化技術研究進展

超氧化物誘導酶（ec1.15.1）被稱為sod。這是一種廣泛存在于動物、植物和好氧微生物細胞中的金屬酶。它可以催化超氧化陽離子自由基o2的脫氧反應，平衡身體代謝過程中產生的過多自由基，減輕或消除身體對自由基的損害，抗衰老、免疫調節、腫瘤抑制、血脂調節、抗輻射、消炎和美容。SOD是當前生物學、醫學以及化學研究領域中世界級的課題之一,且在我國已有專著問世。大蒜是百合科(Liliaceae)蔥屬植物生蒜(AlliumsativumL.)的鱗莖,大蒜中SOD的含量比其它植物相對較高。從大蒜中提取SOD,成本低廉,因此研究大蒜SOD的分離純化方法,對SOD生產工藝優化及應用具有重要意義。1cu/zn-sod與銅原子的構象熔點溫度根據所結合的金屬輔基不同,將存在于高等生物體內的SOD分Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD3種,大蒜SOD屬于Cu/Zn-SOD。Cu/Zn-SOD是由兩個相同亞基構成的二聚體蛋白,每個亞基含一個銅原子和一個鋅原子,相對分子質量約為16kD。通過對其構象熔點溫度的研究表明,Cu/Zn-SOD是迄今發現熱穩定性最高的球蛋白之一。Cu/Zn-SOD的等電點在pH5.3左右,其酸堿穩定性好,在pH5.2~9.6之間其催化速率與pH無關,在pH4.5~11.0之間能穩定存在。與Fe-SOD、Mn-SOD相比,Cu/Zn-SOD對一些化學試劑或變性劑的敏感性有明顯的差別。DTT(二巰基蘇糖醇)、氰化物、H2O2、SDS(十二烷基硫酸鈉)和DTDM(4,4′-二硫代二嗎啉)等對SOD的活力影響顯著,并可將其沉淀,但它在其它理化因素作用下相對較穩定。以上性質也決定了大蒜SOD來源豐富、易于處理,生產工藝也易得到簡化。2大蒜sod的提取、分離和純度2.1磷酸緩沖液浸取大蒜大蒜SOD極性較大,易溶于水,根據“相似相溶”原理,可用水來浸取大蒜SOD。但磷酸緩沖液可提高浸取效能,增加制品的穩定性,減少雜質,因此實際操作中常采用pH7.8的磷酸緩沖液代替水來浸取大蒜SOD,得到粗提取液。但該方法的缺點是浸出范圍廣,選擇性相對差,容易浸出大量的無效成分,且會引起一些有效成分的水解。2.2破碎過程在東南角超聲波破碎法是一種輔助浸取技術。超聲波的“空化作用”產生極大的壓力造成被粉碎物細胞壁或整個細胞的破碎,而且整個破碎過程在瞬間完成。超聲波產生的振動作用增加了溶劑的湍流強度及相接觸面積,加快了細胞內物質的釋放、擴散及溶解,從而強化了傳質,有利于細胞內有效成分的提取。馮艷偉等以超聲波破碎法輔助磷酸緩沖液提取大蒜SOD,并通過單因素試驗法得出最佳破碎功率為300W,最佳破碎時間為5min,同時也指出超聲波會使部分酶失活。2.3熱處理小熱值熱變性法是依據SOD的熱穩定性原理設計的。SOD的熱穩定性高,當溫度低于60℃時,短時間的熱處理不會使酶活力有明顯的變化,而一般的雜蛋白卻在溫度高于55℃時就易變性沉淀,因此,對大蒜粗提液進行短時間的熱處理可以達到去除雜蛋白的目的。孫永君研究得出提取植物SOD的最適宜溫度為55~65℃,最適宜的熱變時間為15min。張書文等則采用二次變溫熱變性法分離SOD,大大縮短了生產周期,降低了生產成本,提高了產品的收率和質量。熱變性法作為一種初步的純化手段,操作簡便,經濟實惠,是工業上常用的分離SOD的方法。2.4有機溶劑分類沉淀法2.4.1丙酮對粗酶液中sod蛋白溶解度的影響利用向蛋白質溶液中加入弱極性的有機溶劑,改變溶液的介電常數,使不同種類蛋白質的溶解度產生不同程度降低的原理可進行蛋白質的純化。在粗酶液中逐量加入丙酮,可使SOD及其他雜蛋白的溶解度發生變化,依次從溶液中沉淀出來。鄧旭等研究認為,當丙酮加入量達到l.0(V/V)時,SOD比活最高,再加入丙酮將導致SOD活力急劇下降,因此當以去除雜蛋白為目的時,丙酮的加入量不宜超過1.0(V/V)。原龍等通過實驗進一步得出,不同的丙酮加入量與攪拌時間會影響SOD的純化結果,其最佳條件是加入0.6倍體積的丙酮,攪拌15min。2.4.2n-sod法氯仿-乙醇混合液可作為萃取劑將SOD溶解于其中,并將雜蛋白沉淀出來。另外,Cu/Zn-SOD對氯仿-乙醇的作用不敏感,處理12h后,活性沒有明顯的變化,因此用該法粗分離大蒜SOD是可行的。張恒等試驗證實,按氯仿-乙醇(V/V=3:5)混合液為提取液量的2.5倍加入氯仿-乙醇混合液,離心分離后棄去沉淀,可得到較純的SOD酶液。2.5植物sod的溶解特性鹽析法是利用在高濃度的電解質溶液內,蛋白質分子表面的水化層被破壞,使蛋白質分子中的憎水區域裸露而導致蛋白質分子聚集沉淀的原理進行分離的。硫酸銨因價廉、溶解度大,且能使蛋白質的性質保持穩定而成為最常用的鹽析劑。孫永君通過試驗表明,當植物SOD粗提液中硫酸銨的濃度從0開始增加時,其中的一些蛋白質的溶解度增加,表現出“鹽溶”特性;但當硫酸銨濃度繼續升高達到50%的飽和濃度時,超過了某些雜蛋白的溶解上限值,其溶解度又會先后以不同的速度下降,分別析出沉淀,而該濃度下植物SOD仍表現出“鹽溶”特性;但由于SOD的沉降系數較小,當硫酸銨的飽和度達到90%時,植物SOD的溶解度才會下降而沉淀析出。孔祥智等則以40%和90%為分步鹽析的最佳硫酸銨飽和點,從大蒜提取物中獲得了SOD和蒜氨酸酶兩種產品。硫酸銨分級鹽析法的優點是方便易行,常溫下也不易導致酶失活,純化效果好,與有機溶劑分級沉淀法相比更有利于保持蛋白質的生理活性,但分辨率不及有機溶劑分級沉淀法。2.6透析膜的制備透析是利用蛋白質分子不能通過半透膜,而使蛋白質和其他小分子物質分開的方法。透析通常不作為純化酶的一種單元操作,但通過透析可除去酶液中的鹽類、有機溶劑、低分子量抑制劑等,所以它在純化過程中極為常用。透析膜的截留極限一般在分子量5000左右,而Cu/Zn-SOD的分子量遠高于此,因此適合于透析法。用透析法提純大蒜SOD的應用已有多次報道。2.7膜分離和濃縮膜分離技術采用了能選擇地透過一種物質,而阻礙另一種物質透過的具有特定性質的半透膜,它的實質是利用物質經過膜的傳遞速度不同而使其得以分離。陸俊等探討了以中空纖維超濾膜分離提純大蒜SOD的工藝,通過正交試驗確定出超濾膜分離法的最佳條件為溫度32℃,壓力0.15MPa,透過率90%,并在此基礎上研究了用納濾膜對SOD超濾液進行濃縮純化的工藝條件,指出適宜的納濾條件為溫度32℃,壓力1.4MPa。JingbingWang等研究了以超濾膜高效分離和純化大蒜SOD的方法,采用分子截留量為50kD的PFS膜,當攪拌速率為1200rpm,滲透通量為26.5L/(m2·h)時,SOD的純度可達98%,并通過實驗證實,增加介質中的銅、鋅離子濃度能顯著提高SOD的比活力(最佳離子濃度為Cu2+62.54mmol/L,Zn2+15.4mmol/L)。膜分離技術是一項新興的分離純化技術,具有被分離成分穩定、分離率高、耗能低、無二次污染、操作方便等優點。3大蒜sod的提取大蒜SOD在各領域中應用廣泛。在化妝品方面,可利用SOD抗氧化、防衰老的特效,研制大蒜美容水、生發水、美容霜、護膚霜、發乳等,現已有多種含大蒜SOD的產品面市;在食品方面,大蒜SOD可作為保健食品的功能因子或食品營養強化劑,如大蒜酒、天然大蒜飲料、SOD酸牛乳、SOD調味劑等;大蒜SOD還可作為抗氧化劑有效防止罐頭、果汁等食品的變質及腐敗現象;也有大蒜SOD作為水果、蔬菜良好保鮮劑的報道。在醫藥方面,大蒜SOD是抗衰老、抗炎癥和自身免疫疾病患者廣泛應用的藥品或藥物原料,大蒜SOD作為牙膏的添加劑,在預防和治療牙周疾病方面也有很高的利用價值;大蒜SOD無抗體干擾,有望在降血脂、治療癌癥、防御放射性傷害等方面起到重要作用。近年來,國內外市場上已出現SOD產品供不應求的趨勢。以往SOD的提取多以動物血為原料,但由于原料來源有限,滿足不了市場的需要,因而從植物特別是無污染天然野生植物中提取SOD,逐漸成為科學界關注的方向。大蒜SOD與動物SOD性質相近,但前者原料來源更為廣泛,取材便利,生產成本低,并符合生態可持續發