鹽脅迫對番茄品種愈傷組織的影響

土壤鹽分嚴重影響了農業生產和生態環境。結果表明，培育耐鹽品種是解決問題的關鍵。番茄屬嚴格的自花授粉植物,長期的人工馴化使其遺傳背景逐漸變窄,一些耐逆境的基因資源很難在栽培種中找到。目前在番茄的栽培種中尚未尋找到耐鹽的栽培材料,故難以通過常規途徑選育出耐鹽的品種。自從Larkin和Scowcroft(1981)系統地評述了在組織培養物的再生植株中廣泛存在著無性系變異以來,這一現象已引起許多研究者的興趣。實踐證明,無性系變異的研究可為育種開辟一條新途徑,特別是當我們想進一步改良某個優良品種而又不希望用雜交的方法大范圍內改變原品種的基本特性時,無性系變異有著不可代替的優越性。根據對番茄離體培養過程中的細胞組織學觀察與研究,番茄愈傷組織的細胞分裂基本為無絲分裂,不定芽再生過程中存在著廣泛的變異。故研究以上海地區的主要栽培品種的親本材料為誘變對象,以下胚軸作為外植體,以NaCl作為選擇壓力,擬篩選出番茄耐鹽突變體。1材料和方法1.1材料表面供試品種為“鮮豐”,由上海市浦東新區蔬菜生產技術推廣站提供。1.2抗鹽傷組織的選擇1.2.1培養基的制備按參考文獻描述的方法培育無菌苗。苗齡為12d時,取下胚軸作外植體,接種于MS+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+30g/L蔗糖+6.5～7.0g/L瓊脂培養基上,約15d后出愈率可達100%。每15d繼代1次,繼代2次的愈傷組織培養物接種于分別附加225mmol/L和300mmol/LNaCl的培養基。約20d后,大部分的培養物在NaCl的脅迫下逐漸褐化死亡,個別褐化的培養物會存有小綠點。將呈綠色的愈傷組織轉至不含NaCl的MS+ZT1.0mg/L+IAA0.2mg/L培養基上分化成苗。1.2.2愈傷組織塊的生長系列NaCl脅迫濃度為75mmol/L、150mmol/L、225mmol/L和300mmol/L。將愈傷組織培養物接種于附加75mmol/LNaCl的培養基上,1周后,選生長相對快的愈傷組織塊接種于高一水平NaCl濃度的培養基上,依次類推,3周后再選生長相對快的愈傷組織塊接種于附加300mmol/LNaCl的培養基上。約2周后,把呈綠色的愈傷組織轉至MS+ZT1.0mg/L+IAA0.2mg/L分化培養基分化成苗。1.3抗鹽體氧化的測定1.3.1培養基的組成將通過直接高鹽脅迫方法得到的耐鹽愈傷組織和通過系列鹽脅迫方法得到的耐鹽愈傷組織的一部分接種于鹽脅迫培養基(分別以V01、V02表示),一部分接種于不含鹽的培養基(分別以V11、V12表示)。繼代7～8代后接種到附加225mmol/L和300mmol/LNaCl濃度的培養基培養,培養30d時測定愈傷組織鮮重和干重,并以原始型(未脅迫篩選過的愈傷組織,以V0表示)為對照計算相對鮮重和干重。1.3.2澆鹽處理和死亡株的篩選選一定大小生根的幼苗進行盆栽基質栽培,定植存活后,進行澆鹽(150mmol/LNaCl)處理,每周1次,一直進行到原始株(以未經過鹽脅迫篩選的再生植株)開花,記載死亡株。1.3.3誘導愈傷組織的誘導按參考文獻描述的方法培育無菌苗,苗齡為12d時,進行2項試驗。試驗1:將1cm長的莖尖接種到分別附加0mmol/L、150mmol/L和225mmol/LNaCl的培養基中,培養30d后統計芽體的生根率、鮮重和干重。每一處理重復20次。試驗2:將形態學最上端1cm長的下胚軸作為外植體進行愈傷組織的誘導。測定在附加了0mmol/L、150mmol/L和225mmol/LNaCl的培養基培養30d后的愈傷組織鮮重與干重。每一處理重復20次。2結果2.1耐400mmol/lnacl的培養基的生長情況2種篩選方法均獲得了耐300mmol/LNaCl的細胞系。獲得耐300mmol/LNaCl的細胞系后,隨即將其一部分轉入附加300mmol/LNaCl的培養基中繼代培養(V01系列和V02系列),同時將另一部分轉入無NaCl的培養基中繼代培養(V11系列和V12系列)。7～8代后,將V01、V02、V11、V12以及原始型V0同時轉入含有225mmol/L和300mmol/LNaCl的培養基生長,30d后進行比較。結果表明,直接高鹽脅迫篩選到的耐300mmol/LNaCl的細胞系在無NaCl的培養基中生長7～8代的V11,再轉入附加225～300mmol/LNaCl的培養基,其生長情況與一直在300mmol/LNaCl中生長的V01相近,鮮重為V0的2.3～3.2倍,干重為V0的2.1～3.2倍。這說明通過直接高鹽脅迫篩選法培育的耐300mmol/LNaCl細胞系在無NaCl的培養基中繼代7～8次以后,仍然保持其耐鹽的能力。而經過系列鹽濃度脅迫得到的耐300mmol/LNaCl的細胞系在無NaCl的培養基中生長7～8代的V12,轉入附加225mmol/L～300mmol/LNaCl的培養基的生長情況與V0相近,這說明通過系列鹽脅迫篩選法培育的耐300mmol/LNaCl細胞系在無NaCl的培養基中繼代7～8次以后,不能保持其耐鹽的能力(圖1)。2.2耐鹽愈傷組織的分化將通過直接高鹽脅迫篩選得到的耐鹽愈傷組織進行分化研究表明:所有耐鹽愈傷組織在附加NaCl濃度高于225mmol/L的培養基上均不能分化成苗;用300mmol/LNaCl高鹽脅迫篩選得到的耐鹽愈傷組織即使轉接到不附加NaCl的培養基上也只能分化出少量的葉狀體,不能成苗。這說明,番茄細胞的分化比增殖對NaCl更為敏感。將在附加300mmol/LNaCl的培養基上鑒定證明保持耐鹽性的愈傷組織,轉至不含NaCl的分化培養基上,得到12株再生苗。2.3耐鹽突變株的生長與鹽脅迫對芽體生長的影響對12株耐鹽變異株進行盆栽澆鹽試驗結果表明,其耐鹽性明顯高于對照,在150mmol/LNaCl脅迫下,變異株的存活率為66.67%,而對照則全部死亡。但只有9號和5號2株變異植株能正常開花結籽。分別用MT-09和MT-05表示。對耐鹽突變株后代耐鹽性的鑒定結果表明:所有的鹽脅迫濃度都明顯降低芽體的生長。在225mmol/LNaCl脅迫下,芽體的生根率明顯下降,但不同材料間差異明顯:MT-09和MT-05的生根率分別達62%和61%,而對照的生根率則為0。在150mmol/LNaCl脅迫下,突變型芽體鮮重的下降幅度明顯低于對照,MT-09和MT-05的下降幅度分別為39%和45%,對照則高達77%。干重的變化趨勢一致(表1)。在150mmol/LNaCl脅迫下,不同材料間在愈傷組織的生長上就表現出明顯的差異。MT-09愈傷組織的鮮重增加24%,而對照則下降28%(表2)。3%nacl對愈傷組織生長的影響Toyoda等(1989)用番茄的葉片為外植體誘導愈傷組織,在培養基中附接番茄細菌性枯萎病病菌(Pseudomonassolanacearum),以病菌產生的毒素作為選擇壓力,成功地獲得了番茄抗細菌性枯萎病的植株,植株的自交后代仍然保持抗性。但也有不同的結果,周榮仁等(1993)將能耐2%NaCl的愈傷組織在2%NaCl的培養基中繼代29次后,再移入無鹽培養基中11和20代后,發現它們不能保持提高了的耐鹽性,分別退化到只能耐1.5%NaCl和1.0%NaCl的水平。而耐2%NaCl的愈傷組織產生的再生植株的自交后代,其萌發種子、幼苗及成長植株均未能表現出抗鹽性,認為這種抗鹽性的提高屬于生理適應性。故Nabors等認為在鹽脅迫條件下能否產生耐鹽的突變體,與鹽濃度與篩選的