耐鹽酵母對醬油風味的影響

柴油的味道是“色、香、味、體”的綜合體現，即汽油的顏色、香氣、味道和體。其中，香味是決定油田味道的重要因素。在醬油的高鹽稀態發酵過程中,一般都要添加耐鹽產香酵母,從而改善醬油的風味提高醬油質量。較常見的耐鹽產香酵母菌有S酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)、T酵母菌(Torulopsisversatilis)和C酵母菌(Candidaetchellsii)。目前醬油中已檢出的風味成分近300種。醬油的風味物質按包含醇類、酯類、酸類、醛類及縮醛類、酚類、呋喃酮類和含硫化合物等。某些風味成分形成途徑已被了解,還有一些風味成分形成途徑尚待繼續研究。風味成分的組成與原料品種、原料配比、菌種、生產工藝及技術管理等有關。了解醬油風味物質的種類及其產生的機制對于如何改造耐鹽酵母從而改善醬油風味提高醬油質量至關重要。1油食品的類型和形成機制1.1鹽水發酵過程中t酵母代謝產物的合成醬油風味成分中含量最多的是醇類,并以乙醇為主。乙醇是由S酵母和糖類共同作用產生的,廣泛存在于整個發酵過程中。糖在S酵母的作用下形成乙醇,但是因為醬油高鹽稀態發酵后期的鹽水發酵中鹽的濃度很高,導致由S酵母發酵產生乙醇的糖類物質種類受到限制。在鹽水發酵過程中,S酵母只能利用葡萄糖卻不能利用麥芽糖。如果在無鹽的條件下,S酵母就能利用麥芽糖。與S酵母不同,在鹽水發酵過程中T酵母能夠利用麥芽糖。在乙醇發酵過程中最關鍵的酶是由ADH1基因編碼的乙醇脫氫酶。醬油中的高級醇主要有丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇等。S酵母和釀酒酵母醇類表現出相似的合成途徑。高級醇的產生直接與氨基酸代謝相關,即氨基酸脫氨基、脫羧基后生成少一個碳原子的醇類。高級醇可以通過埃爾利希(Ehrlich)途徑由相關的支鏈氨基酸產生,這包括一個轉氨反應產生相應的α-酮酸,一個去羧基反應產生相應的醛,然后醛發生還原反應產生醇類。此外,α-酮酸作為關鍵的中間產物,也可在各自的氨基酸合成途徑中直接合成,并直接轉化成高級醇。在線粒體和細胞質中分別由BAT1和BAT2基因編碼的氨基轉移酶是催化支鏈氨基酸代謝的關鍵酶。當然在S酵母中,高級醇類可能還存在其他的合成途徑。向S酵母中加入支鏈的氨基酸導致相應的醇類產量增加。此外,醬油中的苯乙醇是具有玫瑰香氣的化合物,它是由T酵母在發酵過程中經降解,再還原或經碳水化合物代謝和氨基酸的生物合成過程這2種途徑而生成。1.2發酵時酯類物質的變化酯類是構成醬油風味成分的主體,一個酸元和一個醇元即可生成酯。酯類作為基本的香味物質,可使麥芽酚、苯乙醇等關鍵風味化合物的氣味更醇厚,緩沖醬油中鹽分的咸味。醬油中的酯類有多種,由于發酵過程中形成的酸類和醇類是多種多樣的,故生成的酯也是多種多樣的。目前,已經確認醬油中含乙酸乙酯和乳酸乙酯等45種酯類。醬油中高沸點酯類含量較多,而低沸點酯類含量則較少。由ATF1和ATF2基因編碼的乙醇酰基轉移酶催化的乙酰輔酶A和高級醇發生還原反應產生揮發性酯類。除此外,由EHT1和EEB1基因編碼的其他酶類對乙酸乙酯的生成也很重要。1.3碳糖發酵生成乳酸和乙酸醬油風味成分中的有機酸以乳酸和乙酸為主,乳酸菌利用葡萄糖進行乳酸發酵生成乳酸,某些乳酸菌還可利用五碳糖(阿拉伯糖、木糖)發酵生成乳酸和乙酸。其中,乙酸是由乙醇氧化而成。除此之外,醬油中還含有檸檬酸、琥珀酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸等有機酸。醬油中的有機酸類互相起協同效應,豐富了醬油的風味。它們和醬油中的醇類在貯存或烹調過程中起酯化反應,會提高醬油的酯香味,同時有機酸的酸味也可以緩和咸味。1.4醛的調劑作用醬油中的醛類物質有甲醛、乙醛、丙醛、異丁醛、異戊醛、酚醛等。其中代表物質是乙醛,呈辛辣刺激性氣味。醛除一部分由發酵產生的以外,大部分是由氨基酸脫胺、脫羰基生成。微量的醛在醬油香氣中起到調和作用。加熱醬油會提高其中乙醛和一些小分子醛類的濃度,而這些醛類化合物一般可與醇類、甲硫醇等發生縮合反應,產生與本身不同的香氣,使醬油風味更復雜化。1.5乙基愈創苯酚醬油中的酚類物質以揮發性酚為主體,特別是烷基苯酚,其是由來自小麥的原料經米曲霉作用后再經T酵母或C酵母發酵生成的。其代表性成分是4-乙基愈創木酚(4-EG)和4-乙基愈創苯酚(4-EP)。其香氣特點十分明顯、活性強,為醬油帶來類似丁香和煙熏的香味,是醬油的一種主要的香氣成分。4-EG是醬油風味中有代表性的化合物之一,口感有發酵醬油特有的滋味,同時它還具有調節醬油中咸味的作用,增加了醬油的圓潤感。醬油中含有1mgL~2mg/L的4-EG就可以明顯提高醬油的風味。4-EG和4-EP分別來源于4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸。而4-羧基-3-甲基肉桂酸和ρ-香豆酸則來源于醬油生產中的麩皮中。這個轉變過程涉及到脫氨基作用,這也是S酵母無法作到的。1.6化合物類物質及理化性質除了上述特征風味物質外,醬油中還存在著如4-羥基-2(或5)乙基-5(或2)-甲基-3(2氫)-呋喃酮(HEMF)、4-羥基-2,5–二乙基-3(2氫)-呋喃酮(HDMF)、4-羥基-5甲基-3(2氫)-呋喃酮(HMMF)等呋喃酮類物質;2,3-二乙基-2-戊烯、苯乙烯等烯類物質;四氫化萘、甲基萘等萘類物質以及部分有機酸鹽類。其中,HEMF是一種與醬油關系最密切的香氣成分,它具有小甜餅干那樣類似焦糖的香氣。在醬油中HEMF的含量越多越好,它能代表醬油的主體香氣。同時,HEM具有抑制食道癌的作用。目前對HEMF形成機制的研究比較多。五磷酸循環對HEMF的形成至關重要。含有7個碳的HEMF是由含5個碳的氨基化合物與由葡萄糖代謝產生的含2個碳的化合物發生反應產生的。HEMF形成的速率和數量受酵母菌種類、發酵液中葡萄糖和氯化鈉濃度的影響。2鹽酵母的改造由醬油風味物質的種類和形成機制可知,對耐鹽酵母進行改造是改善醬油風味的關鍵。對酵母菌株改造的遺傳操作策略主要包括隨機誘變、有性重組、代謝工程、進化工程和基因組重排等。2.1可誘變的醬油品質菌株的篩選利用誘變劑處理耐鹽酵母菌是改善醬油風味的最經典方法。常用的誘變劑有亞硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)、甲基磺酸乙酯(Ethylmethanesulphonate,EMS)等。通過誘變的方法可以篩選得到醬油風味明顯改善的菌株。如AOKIT等篩選得到的突變菌株產生的2–苯乙醇是野生型菌株的38倍。2.2菌株的雜交試驗改造酵母菌的首要方法就是將不同基因背景的菌株進行雜交。KIMJK將S酵母菌和T酵母菌進行雜交得到的重組菌株使醬油的風味得到了明顯改善,同時縮短了發酵周期。2.3代謝途徑修飾代謝工程是在對代謝流量及其控制進行定量分析的基礎上進行代謝途徑改造,以最大限度的提高目的代謝產物。從廣義上來講,利用分子生物學方法對某一代謝途徑進行修飾也屬于代謝工程的范疇。目前,已經構建了多個S酵母/大腸桿菌的單拷貝和多拷貝的穿梭質粒(如pZEU、pZEL和pZEA),其選擇標記分別為ScURA3、ZrLEU2和ZrADE2。利用這些質粒可以過量表達某一風味物質形成過程中的關鍵蛋白,從而改善醬油風味,滿足人們對醬油不同風味的需求。2.4altranscraptionmortgage模型進化工程就是在達爾文進化理論基礎上進行隨機突變與選擇的一種技術方法,也稱為定向進化。其中,整體轉錄系統工程(globaltranscriptionmachineryengineering,gTME)就屬于進化工程的范疇。gTME是通過易錯PCR突變來改變用于調解基因整體轉錄的關鍵蛋白,并因此使相關基因達到一個新的轉錄水平。gTME已經成功應用到原核生物和釀酒酵母中。確定S酵母、T酵母和C酵母的全局轉錄因子序列是gTME策略能否改善醬油風味的必要條件。2.5微生物群體重組承擔技術基因組重排就是在多個母本雜交基礎上把DNA改組與傳統的育種方法有機結合起來的技術方法。將經典的育種和DNA改組相結合的基因組重排技術為快速的使微生物群體產生復雜后