雞蛋中7種磺酸類化合物的測定

磺胺類藥物（sas）是一種傳統的合成抗菌藥物，在動物和家禽的臨床和繁殖中得到了廣泛應用。但由于磺胺二甲基嘧啶等可誘發嚙齒類動物甲狀腺增生或腫瘤生長,且磺胺類藥物毒性較高,在食品中殘留半衰期長,因此對人和環境危害嚴重。雞蛋是人們首選的價廉質優的營養食品。它以營養豐富、易被吸收、口感良好、價格便宜而深受消費者喜愛。近幾年,中國蛋雞業發展飛速,雞蛋產量大幅增加,但由于國內雞蛋主要來自于千家萬戶和小規模蛋雞場,藥物使用不規范,常造成雞蛋內的獸藥殘留量超標。據NY5039-2001《無公害食品——雞蛋》中規定,雞蛋中磺胺類藥物最高殘留限量(MRL)為0.1mg/kg。但迄今尚未見到有關雞蛋中磺胺類藥物殘留檢測方法的報道,評定無公害雞蛋只能參照蜂蜜或出口肉制品中磺胺殘留的檢測方法。由于雞蛋的物質組成、化學成分、基質脂溶性及干擾物質等與蜂蜜、肉制品不同,致使磺胺藥物在三者間的殘留機制也存在較大差異,且磺胺類藥物在雞蛋的蛋黃和蛋白中的殘留機制和分布亦有明顯區別。鑒此,雞蛋的生產、加工、貿易、質量監控以及管理、評定均迫切需要建立專門的磺胺類藥物殘留的測定方法。本研究選擇國內常用的7種磺胺類藥物,擬通過固相萃取和二極管陣列檢測器,采用高效液相色譜法建立檢測雞蛋中殘留磺胺類藥物的測定方法。1材料和方法1.1標準儲備液制備磺胺類藥物7種:磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)和磺胺喹惡啉(SQX)(含量>99.9%,美國Sigma公司生產);甲醇:色譜純(山東禹王實業有限公司禹城化工產品);二氯甲烷:分析純(汕頭市西隴化工廠產品);乙酸:優級純(南京化學試劑公司產品);正已烷:分析純(上海久意化學試劑有限公司產品);檸檬酸:分析純(江蘇鴻聲化工廠產品);氫氧化鈉:分析純(南京化學試劑一廠產品)。1%乙酸:量取10.0ml乙酸和990.0ml水混合均勻;流動相A:量取1%乙酸70.0ml和30.0ml甲醇混合均勻;磺胺儲備液:精確稱取7種磺胺標準品各10.0mg,分別放入100ml棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成單一標準儲備液,濃度為100.0μg/ml,-20℃避光存放;混合工作液:吸取濃度為100.0μg/ml的7種磺胺儲備液各1.0ml共同放入一個100ml棕色容量瓶中,用流動相A定容至刻度,配成混合工作液,溶液中每種磺胺濃度均為1.0μg/ml,現配現用。1.2儀器、試劑與儀器高效液相色譜系統:Agilent1100Series(美國Agilent公司生產);高速組織搗碎機:DS-1(上海標本模型廠生產);電子分析天平:AL204[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產];旋渦混合器:XW-80A(上海琪特分析儀器有限公司生產);氮吹儀:N-EVAPTM112(美國);調速多用振蕩器:HY-4(常州國華電器有限公司生產);高速離心機(德國Biofuge生產);固相萃取柱:AccuBONDⅡODS-C18Cartridges,500mg6ml(美國Agilent公司生產)。1.3單液氮氣吹干將雞蛋勻漿,稱取勻漿物2.0g置于50ml聚丙烯具塞離心管中,加入檸檬酸鈉緩沖液0.4ml和二氯甲烷10.0ml,激烈震蕩10min,然后中速振蕩提取30min,離心10min(10000g,用移液管吸取下層液體5.0ml于離心管中,35℃水浴氮氣吹干。用1.0ml流動相A溶解殘渣,渦旋混勻,加3.0ml正已烷,震蕩去脂和色素,離心10min(2000g,棄去上層正已烷層,再重復去脂1次。下層加水稀釋至5.0ml,稀釋液注入預先分別用5.0ml甲醇和5.0ml水處理的AccuBONDⅡODS-C18固相萃取柱,經5.0ml水和5.0ml5%的甲醇溶液淋洗后用5.0ml甲醇洗脫,收集洗脫液,于35℃水浴中氮氣吹干,準確加入0.5ml流動相A溶解殘渣,過0.22μm濾頭后供液相色譜測定。1.4流動相b/c色譜柱:ZORBAXSB-C185μm,250mm×4.6mm(i.d.);流動相A:甲醇-1%乙酸(體積比30∶70);流動相B:甲醇-1%乙酸(體積比37∶63);梯度洗脫:在0～13min時用流動相A,13～25min時切換至流動相B;流速:1.0ml/min;檢測器:二極管陣列檢測器;檢測波長:270nm;柱溫:35℃;進樣量:20μl。1.5標準曲線的繪制吸取適量濃度為1.00μg/ml的磺胺混合工作液,用流動相A稀釋至濃度為0.02μg/ml、0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.50μg/ml和1.00μg/ml,作為繪制標準曲線的工作溶液。每個濃度依次從低濃度到高濃度,按色譜條件進行測定,每一濃度重復測定4次,取其所得峰面積平均值繪制色譜峰面積-濃度標準曲線。采用外標標準曲線法定量樣品。1.6加樣回收率試驗自制空白雞蛋樣品。稱取雞蛋勻漿物2.00g置于50ml聚丙烯具塞離心管中,分別添加100.00μl、200.00μl和400.00μl濃度為1.00μg/ml磺胺混合工作液,制成樣品濃度為0.05mg/kg、0.10mg/kg和0.20mg/kg的添加樣,混勻后靜置10～15min,每個濃度4個平行樣品,按照上述1.3的方法進行處理和測定,用外標法測定回收率。2結果2.1標準曲線及線性范圍在選定的色譜條件下,檢測0.02～1.00mg/ml范圍內各濃度的7種磺胺藥物混合標樣,所得的色譜峰面積與藥物的質量濃度呈線性相關關系,其回歸方程和相關系數見表1。表1顯示,其線性響應范圍完全滿足測定的要求,證明該方法定量測定具有很好的可靠性。2.2sm2、smm、sdmx在試驗選定的色譜條件下,測得7種磺胺的保留時間依次分別為SD:4.071min;SM2:6.839min;SMP:7.553min;SMM:9.355min;SMZ:10.594min;SDM:20.689min;SQX:23.863min。色譜峰形及7種磺胺分離度均較好(圖1)。2.3回收率、標準曲線和檢測限空白雞蛋中添加不同濃度的7種磺胺藥物后,經樣品提取、去脂、凈化,HPLC檢測,通過標準曲線計算樣品回收率和不同批次樣品處理的變異系數,結果見表2。從表2看出,本試驗的7種磺胺藥物在添加濃度0.05～0.20mg/kg范圍內,雞蛋樣品的回收率,SD為73.8%～98.8%;SM2為81.5%～96.6%;SMP為73.2%～84.4%;SMM為74.6%～87.1%;SMZ為84.9%～102.6%;SDM為76.9%～84.1%;SQX為79.8%～84.6%。添加7種磺胺藥物各濃度的變異系數均低于9.0%,為1.8%～8.7%。按照檢測限的定義(分析方法能夠從樣品背景信號中檢測出待測物存在時需要的最低濃度),在高效液相色譜條件下,將標樣連續稀釋后進樣,以3倍于噪音峰高的SAs濃度作為最低檢測限,測得:SD、SM2、SMP、SMM和SMZ的檢測限均為0.01mg/kg;SDM的檢測限為0.02mg/kg;SQX的檢測限為0.03mg/kg。3討論3.1提取方法的比較磺胺類藥物SAs含有伯胺基和磺酰胺基,呈酸堿兩性,但主要呈弱酸性,等電點范圍為3～5,極性較高。一般采用極性溶劑提取或堿性溶液與溶劑反萃取凈化的方法處理,常用的提取液有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等。雞蛋營養成分組成與動物肌肉組織和肝臟等不同,因此在提取液的選擇上也略有差別。本試驗比較了3種提取液的提取效果,在雞蛋樣品中加入乙腈后,發現雞蛋發生變性,提取率低,且由于乙腈沸點較高,而磺胺藥物耐熱性較差,用乙腈提取耗時較長。用乙酸乙酯作為提取液浸出的雜質較多,凈化后仍受雜質的干擾,且回收率不高。試驗結果表明,采用二氯甲烷提取時浸出的雜質少,回收率高,易排除基質干擾,效果理想。在提取SAs時,加入適量檸檬酸鈉緩沖液有利于降低乳化和提高振蕩提取的效率。我們曾嘗試加入無水硫酸鈉,但結果表明,在振蕩過程中雞蛋與無水硫酸鈉包裹在一起,形成團塊,明顯降低了提取效率。而換用檸檬酸鈉緩沖液后提取率則顯著提高。3.2最佳比例的確定根據文獻資料,我們對常用的流動相溶劑——甲醇、乙腈、水、磷酸鹽緩沖溶液以及不同配比的多溶劑體系進行了一系列預備試驗。李俊鎖等(2002)選擇乙腈-磷酸(0.017mol/L)體系作為流動相,在1h內完成7SAs與樣品雜質的分離。林海丹等(2003)在測定動物組織中磺胺藥物殘留時選擇一定體積比的甲醇和1%乙酸混合液作為流動相,并確認甲醇與1%乙酸的最佳比例為35∶65(體積比)。參照李俊鎖的方法,雖然7種磺胺藥物都達到基線分離,但整個出峰周期顯然太長,需1h才能完成。考慮到磺胺類結構中帶氨基,有弱堿性,其中性分子和離子形式在有機相與水相中的分配性質不同,有機溶劑和pH對磺胺的保留有著重要影響,我們選用甲醇-1%乙酸為流動相,以改善磺胺藥物保留值和峰形。通過進行不同比例洗脫試驗,在選用甲醇∶1%乙酸=35∶65(體積比)作為流動相時,SMZ組分峰前有一雜質干擾峰,雜質峰和SMZ組分峰部分重合導致回收率超過100%,后通過改變流動相兩者比例,使雜峰與SMZ完全分開,得到甲醇與1%乙酸的最佳比例為30∶70(體積比)。又由于在該比例下,SMZ與SDM之間出峰時間間隔達16min,因此采用梯度洗脫,通過試驗確定,在0～13min時,甲醇∶1%乙酸=30∶70(體積比);13～25min時,將兩者比例切換至37∶63(體積比),這樣將SDM的出峰時間提前了6min左右,雖然與SMZ還有時間間隔,但再增加甲醇比例使得時間間隔縮短將使色譜圖基準線向上傾斜,圖譜變得難以積分。通過該梯度洗脫,7種組分分離效果和峰形好,整個出峰周期控制在25min之內(圖1)。3.3萃取脂溶液的選擇樣品用二氯甲烷提取,由于二氯甲烷屬中等極性溶劑,有可能提取出類脂物,因此提取液濃縮后需要去除類脂物,特別是雞蛋樣品,提取液氮氣吹干后為深黃色油狀物質。本試驗先采用甲醇-正己烷液液萃取脫脂,由于雜質干擾,甲醇與正己烷會產生輕度乳化,且磺胺類藥物呈弱堿性,其在酸性溶液中溶解度大,因此最后確定用甲醇-乙酸-正己烷液液萃取脫脂,直接以流動相(含乙酸、甲醇)溶解殘渣