地衣芽孢桿菌發(fā)酵胡椒過(guò)程中酶活性的動(dòng)態(tài)變化

柴胡是一種重要的亞熱帶香蒲植物，其占比超過(guò)60%。脫皮是白胡椒加工中的關(guān)鍵步驟,傳統(tǒng)使用的水漚法脫皮周期長(zhǎng),勞動(dòng)強(qiáng)度大,特別是漚臭味重,脫皮不徹底,產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。為了克服傳統(tǒng)工藝的不足,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外都在尋求新的白胡椒加工方法,其中利用微生物發(fā)酵進(jìn)行生物法脫皮是白胡椒加工的未來(lái)發(fā)展方向。胡椒微生物發(fā)酵法脫皮的原理是利用接種的微生物產(chǎn)生各種酶類(lèi),分解果皮中的有機(jī)物質(zhì),從而破壞果皮的致密結(jié)構(gòu),即在溫和條件下進(jìn)行一系列“膠養(yǎng)菌,菌產(chǎn)酶,酶脫膠”的生化反應(yīng),使得果皮與胡椒種子(即胡椒粒)分離,達(dá)到脫皮目的。在這個(gè)生化作用過(guò)程中,所需酶類(lèi)一般認(rèn)為是兩類(lèi),即果膠酶和半纖維素酶。在麻類(lèi)脫皮的實(shí)驗(yàn)中,劉自镕等認(rèn)為苧麻脫膠中的關(guān)鍵酶是果膠酶,Akin等和何連芳等研究麻類(lèi)脫膠專(zhuān)用酶制劑時(shí)指出半纖維素酶和果膠酶共同作用才能使麻類(lèi)脫膠的速度加快,且所得麻類(lèi)品質(zhì)更好。但對(duì)于胡椒脫皮過(guò)程中酶作用的動(dòng)態(tài)變化的報(bào)道很少。傳統(tǒng)水漚法脫皮是將成穗胡椒裝在編織袋里,在自然水體中浸漚7~15d,然后在流水中搓洗胡椒使果皮脫除干凈。其原理可能主要是自然水體中多種微生物的共同作用。由于許多腐敗微生物參與該過(guò)程,因此所加工的白胡椒往往帶有明顯的漚臭味。本課題組致力于研究胡椒的生物法脫皮工藝,其中對(duì)胡椒在傳統(tǒng)水漚法和地衣芽孢桿菌發(fā)酵法脫皮過(guò)程中生化指標(biāo)特別是各種酶的變化進(jìn)行研究,為闡明胡椒微生物發(fā)酵法脫皮的生物化學(xué)機(jī)制、為胡椒生物法脫皮的深入研究和進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1樣品及水處理地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)3-x-05由海南大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物研究室篩選。胡椒(PipernigrumL.)鮮果及水漚處理中的胡椒采自海南省瓊海市陽(yáng)江鎮(zhèn)。果膠、D-半乳糖醛酸、木聚糖、木糖美國(guó)Sigma公司;羧甲基纖維素鈉天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。1.2紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)HMS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱寧波江南儀器廠;Hettich32R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Zentrifugen公司;W-1100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司;Delta320-S型pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SW-CT-IFD型超凈工作臺(tái)蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;PB303-N型電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司。1.3方法1.3.1酵母浸膏l(xiāng)種子培養(yǎng)液:果膠2g/L、K2HPO42g/L、NaH2PO42g/L、(NH4)2SO42g/L、NaNO31.5g/L、MgSO40.5g/L、酵母浸膏0.0001g/L。直接用接種環(huán)從試管斜面上挑取2環(huán)地衣芽孢桿菌于種子培養(yǎng)基中,30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)24h。1.3.2地衣芽孢桿菌2-x-05種子液的制備稱(chēng)取3000g成穗胡椒鮮果,熱燙3min,添加1g/L的葡萄糖溶液,料液質(zhì)量比1:3,接種10%的地衣芽孢桿菌3-x-05種子液,28℃靜止培養(yǎng)直至72h胡椒脫皮完成(未脫皮顆粒在30顆以?xún)?nèi),下同)。在脫皮過(guò)程中每隔6h定期取樣,分別測(cè)定發(fā)酵液中的pH值和果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶的酶活力。1.3.3然水體浸法海南省瓊海市是胡椒的主產(chǎn)區(qū),胡椒種植戶(hù)生產(chǎn)白胡椒時(shí)均采用自然水體浸漚法,通常需要7~10d后。從農(nóng)戶(hù)的露天浸漚池中定期(每隔12h)吸取編織袋中央的漚液樣品,同1.3.2節(jié)測(cè)定樣品液中的pH值和果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶的酶活力。1.3.4ph測(cè)量采用pH計(jì)測(cè)定。1.3.5力的測(cè)定方法果膠酶系中聚半乳糖醛酸酶(PG)活力測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS)法。40℃、pH4.0條件下,1mL酶液中1min產(chǎn)生1μg半乳糖醛酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。果膠酯酶(PE)活力測(cè)定采用NaOH滴定法。45℃、pH6.0條件下,1mL酶液中1min釋放出1μmol羧酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。果膠裂解酶(PL)活力測(cè)定采用紫外光譜儀測(cè)定吸光度法。40℃、pH5.0條件下,1mL酶液中1min分解果膠,波長(zhǎng)235nm處吸光度增加0.01所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。木聚糖酶活力測(cè)定采用DNS法。50℃、pH7.0條件下,1mL酶液1min催化木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。纖維素酶系中濾紙酶活力和CMC酶活力測(cè)定采用DNS法。50℃、pH3.8條件下,1mL酶液1min水解纖維素底物生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。2結(jié)果與分析2.1柴胡剝皮過(guò)程中果膠酶活力的變化2.1.1pg對(duì)pg蛋白表達(dá)的影響PG專(zhuān)一水解果膠分子的糖苷鍵,屬于果膠水解酶,能夠有效降低果膠的黏度。從圖1可以看出,在傳統(tǒng)水漚法中PG在32h和132h存在酶活力高峰;而在地衣芽孢桿菌發(fā)酵法中12h就出現(xiàn)酶活力高峰且酶活力比傳統(tǒng)水漚法高。2.1.2地衣芽孢桿菌發(fā)酵法從圖2可以看出,在傳統(tǒng)水漚法中PE酶活力變化不大,一直維持在8500~9500U/mL之間;而在地衣芽孢桿菌發(fā)酵法中,在36h就達(dá)到12216.6U/mL,隨著脫皮時(shí)間的延長(zhǎng),PE酶活力逐漸下降,維持在9500U/mL左右,直到脫皮結(jié)束時(shí)。PE作用于果膠分子,脫去甲氧基,形成果膠酸,在整個(gè)脫皮過(guò)程中,PE酶活力都維持在一個(gè)較高的水平。2.1.3pl酶活力PL主要是通過(guò)反式消去作用切割果膠分子中的α-1,4糖苷鍵,形成果膠分子末端的C4-C5不飽和鍵,能更迅速降低黏度。從圖3可以看出,傳統(tǒng)水漚法中PL酶活力較低,而在地衣芽孢桿菌發(fā)酵法中,6~18h之間PL酶活力維持9.0U/mL左右,且在42~54h出現(xiàn)第2次較高的酶活力。地衣芽孢桿菌發(fā)酵法能更快地完成脫皮,可能與脫皮過(guò)程中存在較高的PL酶活力有關(guān)。2.2木聚糖酶活力變化從圖4可以看出,傳統(tǒng)水漚法中木聚糖酶在36h和132h存在酶活力高峰,但酶活力比地衣芽孢桿菌發(fā)酵法低;在地衣芽孢桿菌發(fā)酵法的脫皮前期木聚糖酶活力較低,從36h起酶活力逐漸上升,在脫皮結(jié)束時(shí),木聚糖酶活力達(dá)到0.086U/mL。對(duì)于兩種脫皮法,木聚糖酶都是在脫皮后期才有較高的酶活力,這可能是因?yàn)槟揪厶敲笇儆谡T導(dǎo)酶,在脫皮后期,果膠酶作用于果皮,使得果皮中的半纖維素暴露出來(lái),從而誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的木聚糖酶。2.3各物理性能的比較從圖5、6可以看出,在整個(gè)脫皮過(guò)程中,兩種脫皮方法中纖維素酶的活力都比較低,由此推測(cè)胡椒的脫皮過(guò)程與纖維素的降解關(guān)系不大。這可能與胡椒鮮果的果皮中含有較少的纖維素有關(guān)。2.4ph值的變化從圖7可以看出,傳統(tǒng)水漚法中,pH值從最初的7.2逐漸降低,脫皮結(jié)束pH值穩(wěn)定在5.5左右;地衣芽孢桿菌發(fā)酵法中,環(huán)境水體的pH值從5h開(kāi)始就降低至pH5.5,脫皮結(jié)束時(shí)pH值在5.1左右。發(fā)酵液的pH值變化與發(fā)酵液中的微生物菌群和發(fā)酵產(chǎn)酶情況關(guān)系密切,傳統(tǒng)水漚法中隨著脫皮的進(jìn)行,多種微生物大量繁殖,代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì),使得pH值逐漸下降;地衣芽孢桿菌發(fā)酵法脫皮前期由于優(yōu)勢(shì)菌株代謝產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)和CO2,使得pH值迅速降低,接著果膠類(lèi)物質(zhì)被分解成小分子的糖類(lèi),pH值下降減緩。3脫果前后木聚糖酶活力變化本實(shí)驗(yàn)對(duì)胡椒鮮果的傳統(tǒng)水漚法脫皮和地衣芽孢桿菌3-x-05發(fā)酵法脫皮過(guò)程中的果膠酶系、木聚糖酶、纖維素酶和pH值進(jìn)行了動(dòng)態(tài)變化研究。結(jié)果表明在脫皮的全過(guò)程中,兩種方法的PG和PL的變化規(guī)律相似,但地衣芽孢桿菌發(fā)酵法中的酶活力水平高于傳統(tǒng)水漚法,且PG和PL酶活力高峰出現(xiàn)時(shí)間更早。PE酶活力都維持在較高水平,但纖維素酶活力都較低,且地衣芽孢桿菌發(fā)酵法的纖維素酶活力隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。兩種方法的pH值總體趨勢(shì)相似,都是逐漸下降,在脫皮完成時(shí)pH值穩(wěn)定在5~5.5;兩種方法的木聚糖酶變化趨勢(shì)有明顯的區(qū)別,傳統(tǒng)水漚法中木聚糖酶有兩個(gè)酶活力高峰,而在發(fā)酵法中,在脫皮前期木聚糖酶活力緩慢增加,從36h開(kāi)始酶活力迅速提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在脫皮前