龍膽瀉肝丸中木通品種的鑒定

木通是臨床常用的藥物。具有強(qiáng)心、利尿、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)理胃腸功能等功效。因?yàn)樗哂星鍩帷⒀a(bǔ)水、通侵的功效，所以在著名的方劑《龍膽瀉肝丸、八正散、赤紅散》中使用。中藥木通又有關(guān)木通、白木通、川木通的區(qū)別,馬兜鈴科植物關(guān)木通因含馬兜鈴酸,極易損害腎臟,造成尿毒癥,現(xiàn)已被主管部門停用;白木通因產(chǎn)量太少而不常用;如今,毛茛科植物川木通使用較為廣泛。但在藥市仍有使用關(guān)木通的現(xiàn)象,至于使用木通的中成藥中木通的品種也很難保證為川木通。本文作者采用薄層層析法、粉末鑒定法和高效液相法鑒別龍膽瀉肝制劑中木通的品種。1下層分析的方法1.1藥品與微生物試劑GOODsee-1薄層色譜攝影儀(上海科哲生化科技有限公司);DL-360E型智能超聲波清洗儀(上海文信儀器有限公司);95%乙醇(分析純)、水(二次蒸餾水)、甲苯、醋酸乙酯、甲醇、甲酸、環(huán)己烷、丙酮,齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110773-201011)馬兜鈴酸A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110746-201004);龍膽瀉肝丸(陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):110804;北京同仁堂制藥有限公司,批號(hào)1082082);川木通、關(guān)木通(購(gòu)自青海省九康中藏藥材市場(chǎng),由中藥學(xué)教授魏全嘉鑒定)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1對(duì)照藥材的制備川木通經(jīng)過(guò)60℃烘干、粉碎(過(guò)80目篩)、稱取粗粉25g,用95%乙醇超聲提取,提取液過(guò)濾,按1∶1比例濃縮,作對(duì)照藥材的溶液。關(guān)木通經(jīng)過(guò)60℃烘干、粉碎(過(guò)80目篩)、取本品粗粉25g,用95%乙醇,加熱回流1h,濾過(guò)、濾液蒸干加乙醇使其溶解,作為對(duì)照藥材的溶液。中成藥龍膽瀉肝丸(水丸)粉碎、取粗粉25g,在蒸餾水中浸泡20分鐘,過(guò)濾,取剩余殘?jiān)?加入95%乙醇超聲提取,濾過(guò),濾液濃縮后作為供試品溶液。1.2.2對(duì)照品溶液的制備取馬兜鈴酸的對(duì)照品加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。取齊墩果酸的對(duì)照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。見圖1。1.2.3苯-醋酸乙酯-水-甲酸溶液的制備硅膠G板(青島海洋化工分廠,規(guī)格50×100);展開劑:關(guān)木通采用甲苯-醋酸乙酯-水-甲酸(20∶10∶1∶1)的上層溶液,展開,取出晾干;川木通采用環(huán)己烷:丙酮(4:1),展開,取出,晾干,噴10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至半點(diǎn)顯色清晰。1.2.4甲苯-醋酸乙酯-水-甲酸對(duì)照品硅膠G板A:從左到右點(diǎn)樣,依次為關(guān)木通對(duì)照溶液、龍膽瀉肝丸供試品溶液(陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、龍膽瀉肝丸供試品溶液(北京同仁堂制藥有限公司)、馬兜鈴酸A對(duì)照品,展開劑選用甲苯-醋酸乙酯-水-甲酸(20∶10∶1∶1)上層溶液。硅膠G板B:從左到右點(diǎn)樣,依次為川木通對(duì)照溶液、龍膽瀉肝丸供試品溶液(陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司)、龍膽瀉肝丸供試品溶液(北京同仁堂制藥有限公司)、齊墩果酸對(duì)照品,展開劑選用環(huán)己烷:丙酮(4∶1),顯色劑選用10%硫酸乙醇溶液,溫度105℃。1.3色譜斑線的測(cè)定用兩種展開劑分別展開的兩種中藥材對(duì)照品、對(duì)照品和供試品,斑點(diǎn)顯色清晰,無(wú)拖尾現(xiàn)象,供試品的色譜,在與對(duì)照品色譜斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上,在紫外燈(365nm)下,顯出相同顏色的斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)所選擇的龍膽瀉肝丸中齊墩果酸顯色斑點(diǎn)與齊墩果酸對(duì)照品的斑點(diǎn)一致,并且均無(wú)斑點(diǎn)與馬兜鈴酸對(duì)照品斑點(diǎn)一致,初步鑒定結(jié)果是:市場(chǎng)選購(gòu)的兩個(gè)廠家生產(chǎn)的龍膽瀉肝丸中所選用的木通均為川木通。2儀表的建立顯微鏡(OLYMPUS)、超微粉碎機(jī)(KCW7015)、Motic成像顯微系統(tǒng)、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、酒精燈、電子分析天平(FA1004上海良平儀器儀表有限公司)。對(duì)照藥材川木通(來(lái)源鑒定同前)、關(guān)木通(來(lái)源鑒定同前)、龍膽瀉肝丸(來(lái)源同前)、水合氯醛、甘油、酒精。2.3研磨成細(xì)粉的制備川木通:稱取川木通對(duì)照藥材10g,將其研磨成細(xì)粉(粒徑符合顯微鑒定要求)。關(guān)木通:稱取川木通對(duì)照藥材10g,將其研磨成細(xì)粉(粒徑符合顯微鑒定要求)。龍膽瀉肝丸:取10粒,將其研磨成細(xì)粉(粒徑符合顯微鑒定要求)。2.3.2水合氯醛用量的確定取一干凈的載玻片和蓋玻片,置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,用鑷子分別取少量藥材粉末(川木通、關(guān)木通、龍膽瀉肝丸)置于載玻片中間,滴加水合氯醛適量,用解剖針攪拌均勻,在酒精燈上加熱透化,重復(fù)2～3次,滴加甘油酒精2～3滴,蓋上載玻片,用吸水紙吸取多余的甘油酒精。2.3.3視聽講座分別觀察兩種藥物的粉末特征,對(duì)比觀察龍膽瀉肝丸中木通特征,鑒別龍膽瀉肝丸中木通的品種。2.3川木通粉末粒實(shí)驗(yàn)觀察在關(guān)木通和川木通粉末的制備片,尋找其特征性組織結(jié)構(gòu):關(guān)木通粉末制備片發(fā)現(xiàn)川木通所沒(méi)有的木栓細(xì)胞(棕色,多角形)草酸鈣醋晶(直徑大約40μm),而在川木通粉末制備片發(fā)現(xiàn)了大量的韌皮纖維(35μm)、木纖維(40μm),未見淀粉粒。在龍膽瀉肝制劑制備片中發(fā)現(xiàn)大量的川木通所含的韌皮纖維(35μm)、木纖維(40μm)。見圖2。3高效液相法3.1儀器和試劑盒3.1.1紫外清洗器設(shè)備高效液相色譜儀(日本島津),LC-10AT泵,ZA-100進(jìn)樣器,N2000工作站,SPD-10A檢測(cè)器,SY1200T超聲波清洗器,ZF-1型三用紫外分析儀。3.1.2龍瀉肝丸、龍瀉肝丸齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110773-200811),龍膽瀉肝丸(陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào):110804;北京同仁堂制藥有限公司,批號(hào)1082082),試劑除乙腈為色譜純外,其他均為分析純,水為重蒸餾水。3.2方法和結(jié)果3.2.1流動(dòng)相、溫度色譜柱:HYPERSILC18200mm×4.6mm5μ,流動(dòng)相:乙腈—0.5%冰醋酸(85:20),流速:0.8ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,溫度:室溫。3.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.08mg,加甲醇定容至50ml,精密吸取5ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò),取濾液作為對(duì)照品溶液。3.2.3供試品溶液的制備取龍膽瀉肝丸(水丸),研細(xì),精密稱取,置小燒杯中,加入適量甲醇超聲提取30min,過(guò)濾,置25ml容量瓶中,定容后搖勻,作為供試品溶液。3.2.4準(zhǔn)分離主溶液的制備取輔料適量,照供試品溶液的制備方法配制成陰性對(duì)照溶液。3.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液2、4、10、16、20μl依次進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=227323.17x-193813.14,相關(guān)系數(shù)r=0.9978。表明齊墩果酸在0.2～2.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.3重質(zhì)譜法鑒定龍膽江中齊墩優(yōu)化物經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比可知;供試品與齊墩果酸對(duì)照品在相同時(shí)間點(diǎn)出峰,可以采用高效液相色譜法鑒別龍膽瀉肝丸中齊墩果酸,以此證明龍膽瀉肝丸中所用的木通是川木通。見圖3。4重新認(rèn)識(shí)龍瀉肝丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和鑒定方法龍膽瀉肝丸是臨床常用的中成藥,有清濕熱、瀉肝火、退黃疸、通淋止帶等作用,但因方中所用的木通,有毛茛科植物川木通、馬兜鈴科植物關(guān)木通、木通科植物白木通三個(gè)品種。其中,因木通科植物白木通產(chǎn)量少,一般不常用。馬兜鈴科植物關(guān)木通因含有對(duì)人體腎臟有害的馬兜鈴酸,已經(jīng)被主管部門禁用。現(xiàn)毛茛科植物川木通使用較廣泛,但在藥材市場(chǎng)上常見到以關(guān)木通冒充川木通。至于龍膽瀉肝丸中所用木通品種,用一般宏觀方法很難鑒別。國(guó)內(nèi)中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究部門對(duì)龍膽瀉肝制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了限定,也只是對(duì)主要藥物龍膽、梔子、黃芩做了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),文中未涉及到需檢測(cè)的川木通中的齊墩果酸或關(guān)木通中的馬兜鈴酸。因此,對(duì)龍膽瀉肝制劑毒性成分的檢測(cè)尚需研究制定。薄層鑒定常用于提取、分離、鑒定天然藥物成分的基本方法,簡(jiǎn)便可行。我們鑒定了關(guān)木通中的馬兜鈴酸、川木通的齊墩果酸和龍膽瀉肝丸中與此相關(guān)成分,收效滿意,實(shí)驗(yàn)所選擇的龍膽瀉肝丸中的齊墩果酸顯色斑點(diǎn)與齊墩果酸對(duì)照品的斑點(diǎn)一致,初步鑒定龍膽瀉肝丸中所用木通為川木通。粉末鑒定是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的鑒定方法,彌補(bǔ)顯微切片鑒定不足之處,尤其是中成藥中某種組織有特征的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)觀察到關(guān)木通、川木通組織結(jié)構(gòu)特征,并從已被鑒定含有川木通的龍膽瀉肝丸中發(fā)現(xiàn)與川木通中含有的韌皮纖維、(35μm)木纖維(40μm