第三章介紹生物轉化的常見反應類型以甾體化合物的生物轉化為例進行闡述甾體化合物和甾體藥物簡介甾體化合物結構

甾類化合物常見種類1ppt課件甾體化合物和甾體藥物簡介1952年，美國普強藥廠的Morray和Pereroon首次利用黑根霉將黃體同轉化為11黃體酮，人們開始認識到甾體微生物轉化在甾體藥物生產中的重要性。微生物幾乎對甾體的每個位置都能進行轉化。幾種重要的甾體微生物轉化發應如羥化，脫氫成為工業上生產甾體激素及其類似物的重要手段2ppt課件甾體化合物一類含有環戊烷多菲核的化合物在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3，11,17位，可能有羥基、酮基；A，B環有部分雙鍵；17位有不同的測鏈。3ppt課件目前甾體微生物轉化中受到人們廣泛關注的領域將微生物基因工程的新技術應用于甾體微生物轉化提高水不容性底物的溶解度細胞和酶的固定化以利于酶的重復經濟利用發展經濟有效的產物連續回收方式將環糊精等應用于培養基以提高產量4ppt課件甾體化合物結構5ppt課件甾體化合物編號6ppt課件甾類化合物常見種類

動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。植物中：薯芋皂豆甾醇酵母細胞：麥角固醇7ppt課件甾體化合物編號8ppt課件甾類化合物常見種類

動物組織中：膽固醇、膽酸、皮脂素、皮脂醇（氫化可的松）、皮脂酮等睪酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激素。植物中：薯芋皂豆甾醇酵母細胞：麥角固醇9ppt課件甾體類激素藥腎上腺皮脂激素類可的松、強的松、氫化可的松

功能：抗炎、抗毒、抗過敏對風濕、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡等有治療作用。生殖腺激素孕酮、雌酮

功能：調節內分泌人工合成避孕藥長效孕酮等10ppt課件微生物在甾體藥物生產中的應用

主要分為兩大類將天然原料轉化為生產甾體化合物的普通中間體。如植物皂角苷羥化生成皂角苷配基降解甾醇邊鏈生成有用的甾體化合物中間體，雄甾－4－烯－3，17－二酮；雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮。轉化成特殊的甾體化合物的中間體，以生產我們所需要的產物。如：甾體11，11及16羥化，?1脫氫甾體邊鏈降解11ppt課件微生物對甾體化合物的轉化微生物對甾體化合物的轉化多種多樣它們對甾體的每一位置上的原子或基團都有可能進行生物轉化。其反應類型主要有氧化、還原、水解、酯化等等。包括甾體母核上和測鏈上的某個位置的羥基化、酮基化、環氧化、脫氫形成雙鏈、芳香化、開環、形成內酯、側鏈斷裂、降解。12ppt課件羥基化反應是甾體微生物轉化中最重要的反應。化學法除了較容易在C17引入羥基外，在其他位置都很難引入羥基。13ppt課件微生物對甾體的羥基化作用微生物能在甾體的任何位置進行羥基化發應，也可在非甾類有機分子上羥基化。簡單的羥基化作用是在甾體的某個位置上引入O原子。在甾核上至少有21個位置可以發生。11位羥基化作用最重要，11位C的氧化對可的松藥物療效是不可缺少的，11，11。除11位C進行羥基化反應外，9，14，16的羥基化，在制備甾體藥物時，生產皮質甾類化合物及其類似物。14ppt課件進行甾體羥基化作用的微生物轉化物質作用位置微生物代表孕酮1111黑根霉、黑曲霉、臘狀桿菌等彎曲孢霉化合物S1111黑根霉、黑曲霉、焦曲霉構巢曲霉假單孢桿菌、弗氏鏈霉菌、梨頭霉11脫氧皮脂酮11彎月彎孢霉雌二醇16巨大芽孢桿菌15ppt課件羥基化反應機理16ppt課件羥基化反應由于這些酶能將一摩爾分子氧引入底物，因此被定義位單氧化酶。這種細胞色素p450依賴的單氧化酶存在于幾乎所有形式的生命體中，以游離或膜結合的形式存在。17ppt課件同位素實驗證明18ppt課件甾體羥基化中存在的問題19ppt課件環糊精的生理作用

Hesselink等研究：應用環糊于分枝桿菌甾體邊鏈的降解。環糊精是一種環狀寡聚糖，一般由6－8個葡萄糖分子通過－1，4糖苷鍵連接而成。易溶于水。含有疏水性空腔，可與疏水性分子結合。可作為幾種甾體類藥物的穩定劑和增溶劑。20ppt課件環糊精的應用實例1Chincholkar等研究了在環糊精存在時，CurrulariaVKMF-644對11－脫氫皮甾醇（ReichsteinS化合物，簡稱化合物S）的11羥基化。在底物濃度為4g/L時：化合物S：－CD＝1.0:0.6氫化可的松的產率為70％－75％無－CD：氫化可的松的產率為40％－50％21ppt課件環糊精的應用實例2GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－雙酮經Penicilliumraistrickii進行15羥基化――――口服避孕藥?5－D－十八甲基炔諾酮（gestodene）的重要中間體。Schlosser等研究表明：在－環糊精存在時，菌株或其固定化細胞對CD的15羥基化作用，與以甲醇做溶劑比較，其轉化率都能明顯提高。22ppt課件環糊精作用環糊精有利于提高甾體底物溶解度真菌能以環糊精作為C源23ppt課件其他重要的羥基化反應地索高諾酮（destogestrel）新型避孕藥（荷蘭Organon公司推出）作用：月經周期控制好，副作用少，避孕可靠我國研究：上海醫科大學史紀平19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－雙酮―――11羥基化（金龜子綠僵菌）形成關鍵中間體簡化合成路線，降低副反應。底物：0.2%轉化率：36％24ppt課件甾體的邊鏈降解25ppt課件側鏈降解微生物對甾體側鏈的降解，解決了天然甾體化合物作原料合成甾體激素的問題，為利用原價的原料開辟了新的途徑。常見微生物有：簡單節桿菌球形芽孢桿菌玫瑰芽孢桿菌淡紫青霉藤黃諾卡氏菌26ppt課件甾體邊鏈降解甾體母核降解27ppt課件28ppt課件3－羥基－?5甾醇

9羥基化，?1，2脫氫3－酮－?4化合物微生物種類不同?1，2脫氫，9羥基化29ppt課件

甾體邊鏈降解采用類似脂肪酸氧化的氧化過程，最后形成C17酮甾體。30ppt課件31ppt課件選擇性邊鏈降解問題選擇性邊鏈降解策略（3）輔助基因工程提高邊鏈降解的產率策略32ppt課件選擇性甾體邊鏈降解措施1

對甾醇進行結構改造，從而阻止酶對母核的降解

例如：1965Sih等將膽固醇先行改造為19羥基衍生物再經一步微生物轉化為A環芳香化的雌酚酮。

33ppt課件選擇性甾體邊鏈降解措施2加入酶抑制劑，抑制母核降解關鍵酶如：C1，2脫氫酶和9羥化酶。如：

NiCoPbSe8－羥基喹啉應用于多種分枝桿菌對膽固醇的選性邊鏈降解金屬鰲合劑2，2－雙聯吡啶抑制母核降解34ppt課件選擇性甾體邊鏈降解措施3對菌株進行誘變，產生僅降解甾醇側鏈的突變株例如：原始菌株經誘變為誘變菌株Mycobacteriumsp，NRRL-B3683

不加抑制劑，便產生雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）再誘變得Mycobacteriumsp，NRRL-B3805，無C1，2脫氫酶能產生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）35ppt課件基因工程新技術的應用專利：Pseudomonas

菌株無降解甾體的能力將MycobacteriumspNRRL-3683

的DNA導入Pseudomonas

菌株中獲得重組菌。重組菌可在水相，一種或幾種有機相中進行轉化反應。Pseudomonas

菌株比MycobacteriumspNRRL-3683的生長輸率快結果加快轉化進程，降低成本。36ppt課件方法分離純化MycobacteriumspNRRL-3683的DNA整合到特定質粒載體中導入噬菌體中用入噬菌體感染E.coliHB101，得E.coli重組子三親雜交實現MycobacteriumspNRRL-3683的DNA到Pseudomonas

菌株得轉移。37ppt課件如何提高甾體邊鏈降解的產率接觸38ppt課件提高甾體邊鏈降解速率Hesselink等研究表明：環糊精能明顯增強MycobacteriumspNRRL-3683降解膽固醇、谷甾醇等邊鏈生成AD的產率，不影響細胞生長速度和細胞密度。當環糊精：底物濃度=2:1時，微生物降解邊鏈的活性可增加1.7-3.0倍。環糊精能阻止母核的降解及產物的反饋抑制。39ppt課件

環糊精在甾體邊鏈降解中的

作用總結

在甾體邊鏈降解過程中，環糊精充當：惰性甾體增溶劑反應載體保護劑40ppt課件甾體邊鏈降的成功應用Arhna和Sih等研究報道以膽甾醇和－谷甾醇為原料微生物轉化法合成甾體藥物中間體的方法。采用酶抑制劑生化阻斷變株改變細胞膜通透性等生物技術改造甾醇的結構，從而選擇性控制甾醇的邊鏈降解成功合成中間體雄甾－4－烯－3，17－二酮（4－AD）雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD）

9羥基－4－AD目的：工業生產性激素，利尿劑等甾體藥物41ppt課件其他的甾體生物轉化反應類型脫氫作用A環芳香42ppt課件脫氫作用－使甾體核形成雙鍵強的松（去氫可的松）是可的松經脫氫而形成的。其抗炎功效比可的松高幾倍。一般制備該種藥物時，常常是將可的松或氫化可的松脫氫變為去氫可的松或去氫氫化可的松。43ppt課件脫氫反應的常見微生物為

簡單節桿菌各種芽孢桿菌（蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌）鐮刀霉長蠕孢菌屬。44ppt課件A環芳香化

所謂A環芳香化是指甾體A環核上的每個C原子都脫氫形成雙鍵，而變為芳香化結構。雌性激素的生產（雌二醇），可通過此方法獲得45ppt課件研究生物轉化的幾種常用方法46ppt課件第四章研究生物轉化的幾種常用方法間歇培養法整體細胞轉化法洗滌均絲懸浮法（靜息細胞法）孢子轉化法原生質體實驗法遺傳特性誘變法同位素示蹤法47ppt課件間歇培養法（Batchculture)這種方法能夠比較直接而簡單地篩選能否具有轉化某種化合物的活性菌株。48ppt課件游離的整體細胞游離的整體細胞直接作為催化劑來制造產品的報道已經不少在某種程度優于固定化細胞在生物轉化酶工程中越來越受到重視游離整體細胞的基礎研究更為重要49ppt課件

游離整體細胞的基礎研究內容

細胞的滲透化酶的胞內固定化酶細胞在反應前后的形態變化和結構變化50ppt課件

整體細胞轉化應用舉例

底物：富馬酸產物L－天冬氨酸生物轉化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）轉化菌株：E.coli51ppt課件整體細胞轉化研究52ppt課件培養基53ppt課件培養方法54ppt課件55ppt課件不同底物濃度的反應速率底物質量濃度較高時，在某一時間（8h）前，轉化速率較低，而后，反應速度加快。對底物富馬酸鹽的轉化徹底。（99.2％）底物濃度較低時，反應速度始終較慢對底物富馬酸鹽的轉化不徹底。（63％）特點：高質量底物濃度有較高的反應速率高質量濃度底物有較高的轉化率催化反應一般有個遲滯期56ppt課件酶細胞在生物轉化中的形態變化

低底物濃度掃描觀察

57ppt課件酶細胞在生物轉化中的形態變化

高底物濃度掃描觀察

58ppt課件形態學變化高質量底物濃度下細胞發生明顯的形態學變化細胞表面發上皺褶，有明顯的凹陷細胞膜變薄，松弛、不明顯，內部結構變松，不致密。59ppt課件高質量濃度底物對含酶細胞的滲透化作用60ppt課件61ppt課件靜息細胞法

為了排除原培養基中自身的代謝產物對不同生長階段轉化的影響，常常用洗滌的靜息細胞來代替發酵液中的生長的細胞，即將不同生長階段的細胞取出，洗去沾染的原培養液及其代謝產物，然后把細胞懸浮在人工轉化系統內，在一定條件下進行生物轉化。62ppt課件孢子轉化法

真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶活力高，且常常用于生物轉化。細菌的內生孢子（芽孢），一般無轉化活性。63ppt課件轉化方法

相似于靜息細胞法。不采用完全培養基，只選用緩沖液或含有葡萄糖一類能源的物質即可。通常轉化時使用的孢子濃度為108－109個/ml.

轉化pH一般為5-664ppt課件原生質體試驗法方法通過溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等脫去細胞壁，獲得原生質體。將原生質體懸浮于高滲穩定液中，添加前體物質，進行喂養試驗，觀察結果。65ppt課件原生質體試驗法特點排除了細胞壁通透性障礙。保全了整體細胞的內酶