生物化學與分子生物學實驗

生物化學與分子生物學系2020/12/121生物化學與分子生物學實驗實驗室規則實驗室安全及防護實驗室常用玻璃儀器實驗考試2020/12/122精品資料你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結一節課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”實驗室規則提前5分鐘到實驗室，不能遲到、早退、曠課，每遲到、早退一次扣1分，每曠課一次扣5分。禁止在實驗室內吃食品，如有違反者按遲到處理。上課必須穿隔離衣，不能穿拖鞋和吊帶背心，否則禁止進入實驗室。實驗期間手機必須設置在振動上，上課期間如急需接、打電話請到走廊上處理。在實驗室內要保持安靜，不得嬉鬧、大聲說話。認真預習認真做實驗養成良好的實驗習慣（實驗中、實驗結束后）值日生工作2020/12/125實驗室安全及防護預防火災預防中毒外傷2020/12/126實驗室常用玻璃儀器吸量管***(示教)試管燒杯量筒2020/12/127實驗考試實驗課成績平時表現實驗測驗原理實驗報告----格式結果操作考試分析2020/12/128實驗報告網上提交實驗報告采取網上提交的方式，實驗報告提交時間設定為3天，即本次實驗結束后第三天晚上12點之前提交，過期無法再提交，本次實驗報告則記為0分。盡早提交報告，不要等到最后期限，有時系統不穩定，可能提交不上去。直接將報告粘貼在框中，切記不要以附件方式上傳，否則有可能文件打不開，影響成績。不要相互抄襲，一旦發現雷同卷則均記為0分。若過期沒有提交報告，不要將報告發到老師郵箱，發也沒用，最終實驗報告成績只記系統導出的成績。2020/12/129實驗一分光光度技術及蛋白含量測定2020/12/1210理論掌握分光光度技術的基本原理了解分光光度計的基本構造實驗:利用分光光度技術進行蛋白質含量測定

1.雙縮脲法測定蛋白質含量

2.考馬斯亮蘭結合法測定蛋白質含量

3.紫外分光光度法測定蛋白質含量

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一、概念

利用物質特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的一項技術。

應用：定性、定量

優點：靈敏度高精確度高操作簡便、快速

分光光度技術（Spectrophotography）2020/12/1212二、工作原理物質對光線有選擇性吸收作用。每種物質都具有其特征性的吸收光譜。在一定條件下，物質對光的吸收程度與該物質的濃度成正比。

分光光度法所使用的光譜范圍：200nm~10μm

200~400nm400~760nm760~10μm

紫外光區可見光區紅外光區2020/12/1213如何定性？

—利用吸收光譜曲線鑒定化合物

吸收光譜曲線：

以不同波長的單色光作為入射光，測定某一溶液的吸光度，以波長為橫軸，吸光度為縱軸作圖，得到溶液的吸收光譜曲線。

每種物質有其特征性的吸收光譜，故可作為定性分析的依據。

吸光度2020/12/1214

1.朗伯（Lambert）定律

一束單色光通過一光吸收介質時，其光強度隨吸收光介質的厚度增加呈指數減少。

I1/I0=e-K1l2.比爾（Beer）定律

一束單色光通過一光吸收介質時，其光強度隨吸收光介質的濃度的增加呈指數減少。

I1/I0=e-K2CI0:入射光強度；I

:透射光強度；l：介質厚度C：介質濃度如何定量？

—

Lambert-Beer定律***2020/12/1215

3.Lambert-Beer定律***

一束單色光通過某溶液時，光波被溶液吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和溶液厚度成正比。

A=εCL

A：吸光度；C：溶液濃度；L：液層厚度

ε：即摩爾吸光系數，指一定波長時，溶液的濃度為1mol/L，光程為1cm時的吸光度值

。*在波長、溶液和溫度確定的情況下，ε由物質的特性決定的。

2020/12/12164.計算***（1）標準管法（標準比較法）

實際測定過程中，用一已知濃度的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據前式計算。

A標準=ε標準C標準L標準

A樣品=ε樣品C樣品L樣品

A：吸光度；ε：摩爾吸光度；

C：溶液濃度；L：液層厚度2020/12/1217

因標準液和樣品液中溶質為同一物質，

ε樣品=ε標準因盛標準液和測定液的比色杯徑長相同

L樣品=L標準

故上二式可寫成：

A標準/A樣品=ε標準C標準L標準/ε樣品C樣品L樣品

C樣品=A樣品/A標準×C標準2020/12/1218（2）標準曲線法

繪制標準曲線：配制一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標，吸光度為縱座標，在方格座標紙上作圖得標準曲線。獲取樣品的濃度：根據測得樣品的吸光度值從標準曲線上獲得測定物的濃度。

濃度吸光度2020/12/1219標準曲線使用注意事項標準曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。吸光度在0.05～1.0范圍內。所作標準曲線僅供短期使用。標準曲線制作與測定管測定應在同一臺儀器上進行，避免誤差產生。2020/12/12205．應用中注意的問題***Lambert-beer’slaw的偏離：該定律只適應于一定濃度范圍，A宜在0.05～1.0之間；選擇波長：最大吸收波長；a.靈敏；b.避免雜質干擾

參比溶液（空白管）：消除背景效應，應包含除待測溶質以外所有的成分。2020/12/1221

空白管：

測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會產生一定的光吸收，故設置一個空白管，即其中除了待測溶質以外，其它的成分完全相同。測量時，首先以空白管對準光路對儀器調零，既消除比色皿本身對光的吸收，又消除了非待測物對光的吸收，所測值即為待測物造成的光吸收。2020/12/1222分光光度計(spectrophotometer)一．基本部件單色器光源狹縫吸收池檢測系統、測量裝置鎢燈氫燈棱鏡光柵比色皿/比色池2020/12/12232020/12/1224

二、分光光度計使用步驟（示教）

三、使用時注意事項**

1.

波長選擇。

2.機器預熱。

3.

不測量時，應使樣品室蓋處于開啟狀態，否則會使光電管疲勞。

4.不應把成有腐蝕性液體的比色皿放在儀器表面。2020/12/1225

5.比色皿使用注意事項***

由于紫外光不能透過玻璃比色皿，紫外光區測量時要用石英比色皿。

同組使用的比色皿必須配套（規格、新舊程度一致）。比色皿有2光面與2毛面，光學表面對準光路，不能有任何污損，否則會引起光吸收的增加。2020/12/1226

比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液體約占全部容積的2/3。腐蝕性溶液不得長期盛放在比色皿中。每次使用后,應立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水沖洗比色皿3～4次。

*本次實驗，考馬斯亮藍可使玻璃比色皿著色，酒精浸泡后清洗。2020/12/1227蛋白質定量分析實驗

實驗一雙縮脲法測定蛋白質含量

（p50）

實驗三

考馬斯亮蘭結合法測定蛋白質含量（p52）

實驗四紫外分光光度法測定蛋白質含量

（p53）2020/12/1228

實驗一雙縮脲法測定蛋白質含量【基本原理】

蛋白質分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結構類似，在堿性溶液中能與銅離子結合成紫色的化合物（稱雙縮脲反應）。在一定濃度范圍，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，故可用比色法測定蛋白質的含量。含有兩個以上肽鍵的物質才有此反應，故氨基酸無此反應。

雙縮脲法的靈敏度為1-20mg。2020/12/1229試劑（ml）123456標準蛋白質溶液0.10.30.50.70.9—生理鹽水0.90.70.50.30.11.0雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.0【操作步驟】（一）標準曲線的繪制1.取小試管6支，編號按下表操作

2．混合后，于37℃水浴中放置15分鐘，在540nm波長下比色，以

第6管調零，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪成曲線。2020/12/1230（二）樣品測定：取樣品0.1ml，加生理鹽水0.9m1，再加雙縮脲試劑4m1，于37℃水浴中放置15分鐘，測其吸光度，根據吸光度值查標準曲線并計算得出樣品中蛋白質的濃度。

注意：雙縮脲法的靈敏度為1-20mg，取蛋白標準液時注意濃度。實驗時，樣品管可與標準管同時處理2020/12/1231【基本原理】

考馬斯亮蘭G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質可通過范德華力結合，與蛋白質結合后顏色由紅色轉變成藍色，最大吸收峰從465nm變成595nm，能過測定595nm處的光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。優點：靈敏度高，1-5μg；測定速度快；干擾物質少。

實驗三考馬斯亮蘭結合法測定蛋白質含量2020/12/12321．取試管3支，編號按下表操作

試劑（ml）空白標準標本生理鹽水0.1蛋白標準液(50ug／ml)0.1樣品0.1考馬斯亮藍試劑5.05.05.02.混勻，放置5分鐘，在波長595nm處，以空白管調“0”，測定各管的吸光度。【操作步驟】2020/12/12333.計算

A標本/A標準×50（μg/ml）=樣品中蛋白質的含量（μg/ml）

注意：蛋白標準液濃度50μg/ml2020/12/1234實驗四紫外分光光度法測定蛋白質含量【基本原理】

由于蛋白質分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白質具有吸收紫外光的性質，吸收高峰在280nm波長處。由于各種蛋白質所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內，吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系，可作定量測定。靈敏度：50-100μg2020/12/1235【操作步驟】（一）制作標準曲線1.取試管6支，編號，按下表操作。試劑