第六章組織工程TissueEngineering

組織工程的概念

應用工程學和生命科學的原理與方法,將在體外培養(yǎng)、擴增的功能相關的活細胞種植于多孔支架上,細胞在支架上增殖、分化,構建生物替代物,然后將之移植到組織病損部位,達到修復、維持或改善損傷組織功能一門科學。種子細胞支架材料訊息因子三要素自體細胞異體細胞和異種細胞干細胞天然高分子天然無機物合成高分子營養(yǎng)生長因子物理和化學環(huán)境應力和應變組織工程細胞的三維培養(yǎng)皮膚組織工程骨組織工程

ForPowerPoint97-2010展示內容組織工程細胞的三維培養(yǎng)

生長因子與細胞培養(yǎng)應力與細胞生長支架材料與細胞粘附

三維培養(yǎng)

在體內情況下，多種生長因子都由機體協(xié)調作用，因而是一個多因子序貫作用體系：體外如何模仿實施這一多因子序貫調節(jié)是組織工程的重大課題。細胞生長與生存微環(huán)境的關系；功能細胞與支持細胞的相互關系；功能細胞的生長繁殖與應力等物理因素的關系；功能細胞與其支持物——ECM的關系；功能細胞的生長繁殖與三維空間的關系

生長因子與細胞培養(yǎng)骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein,BMP)

在動物長骨的皮質骨中含量較多誘骨活性：誘導間充質細胞不可逆地分化為軟骨和骨細胞。將BMP注入軟組織，可異位誘導新骨的形成。

BMP已經(jīng)成功用于治療骨折、骨延遲愈合、骨不連接及骨缺損。表皮生長因子（EGF）與角膜損傷的修復刺激角膜上皮增殖給兔角膜人為造成損傷，EGF滴眼給藥可明顯加快受創(chuàng)角膜的愈合。成纖維細胞生長因子（FGF)血管內皮細胞生長因子（VEGF)胰島素樣生長因子（IGF)轉化生長因子-β(TGF-β)應力與細胞生長

當材料在外力作用（受力、濕度變化等）下不能產(chǎn)生位移時，它的幾何形狀和尺寸將發(fā)生變化，這種形變稱為應變。

材料發(fā)生形變時內部產(chǎn)生了大小相等但方向相反的反作用力抵抗外力，定義單位面積上的這種反作用力為應力。切應力

張應力

壓應力

拉應力細胞流體切應力（flowshearstress）：主要指血流對血管壁施加的力。切應力對細胞骨架的影響：切應力作用于體外培養(yǎng)的內皮細胞時，細胞骨架會發(fā)生改變，細胞膜內側出現(xiàn)肌動蛋白纖維，細胞內形成粗而長的應力纖維，并與膜附著。細胞變?yōu)殚L梭形，沿著切應力方向排列。高血壓引起血管內皮細胞中應力纖維增加。

微管可能是內皮細胞機械應力刺激作用的靶標，切應力通過它改變內皮細胞的形態(tài)、影響細胞的黏附與遷移等功能，從而在血管重建中發(fā)揮重要作用。

切應力對照0.5h3h12h切應力對內皮細胞微管骨架重構的影響張應力（tensilestress）：心臟搏動、肌肉收縮、肌腱和韌帶的拉伸、血管充盈時對血管壁的牽拉、呼吸對肺泡的牽張。靜態(tài)培養(yǎng)構建的組織工程化肌腱雖然有很好的組織學特性，但其抗拉強度始終低于正常肌腱。可能缺乏足夠的力學刺激。張應力能夠引起細胞骨架重排及細胞形態(tài)的變化。張應力大鼠骨髓間充質干細胞加力前后細胞骨架形態(tài)變化A.不加力B.加力12h后壓應力（compressivestress）人體的所有關節(jié)都是由骨性組織構成它的主要部分，關節(jié)內側緣大多受到壓應力的影響。拉應力大腦、脊髓和內臟器官在人體內都呈現(xiàn)懸掛式的，因受到地球引力的作用，它自身的重量就形成了對抗性的拉力，所以受到拉應力的影響，其他的軟組織的兩端或周邊都附著在其他的組織結構上，因此也都受到拉應力的影響。

壓應力和拉應力細胞對機械應力應答機制

生理條件下，細胞之間相互聯(lián)系。二維細胞培養(yǎng)因重力的影響導致細胞間聯(lián)系失常，無法形成立體的組織和器官。三維細胞培養(yǎng)即把細胞懸浮在培養(yǎng)液中，但常用的氣泡和攪拌器法，對細胞產(chǎn)生破壞性的應力。旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)細胞和組織繞水平軸建立均質的液體懸浮軌道，從而中和了大部分重力效應，處于微重力狀態(tài)。細胞受到的剪切力很小。試驗發(fā)現(xiàn)，離體細胞在RCCS中呈現(xiàn)高密度聚集,并形成較大的組織樣結構。美國宇航局（NASA）生命中心開發(fā)研制旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（rotarycellculturesystem,RCCS）1）固定蛋白質2）固定多肽類物質3）固定氨基酸及其衍生物

4）固定細胞生長因子

表面粗糙時，可使細胞與材料接觸的表面積增加，以促進細胞在材料表面的濕潤作用，影響細胞的粘附強度。1）材料的生物可降解性

2）合成聚合物

3）蛋白質吸附粘附的最適條件與蛋白質在材料表面的吸附能力有關

.材料表面物理性質材料表面化學性質材料表面幾何性質

材料表面生物修飾細胞與支架材料的粘附

中等濕潤度的材料表面粘附性最強；材料表面電荷量影響細胞粘附性，細胞在帶正電荷的材料表面上的粘附增加。RGD可被固有粘附蛋白受體特異性結合，在生物材料表面自發(fā)形成一分子層，為與受體介導的細胞反應提供位點，促進細胞粘附、伸展。粘附微島：采用微晶圖技術在材料表面制成具有確定尺寸、形狀及圖案的粘附三維培養(yǎng)

組織工程的核心：建立由細胞和生物材料構成的三維復合體定義：利用各種方法及材料,使細胞呈空間立體方式生長,更接近于體內生長模式,形成類似體內組織的結構。

細胞三維培養(yǎng)能夠為體外培養(yǎng)細胞提供與其組織來源相似甚至相同的細胞生長微環(huán)境和細胞聯(lián)系,從而既有利于各類細胞的分化定向誘導,又有利于細胞分化表型的維持和增殖。

支架材料的物理線度影響細胞生長速率，材料越厚，生長越慢；支架材料的網(wǎng)孔大小必須適當，以便種子細胞易于跨越網(wǎng)孔而又不至于引起接觸抑制。

分為靜止三維培養(yǎng)和動力性三維培養(yǎng)。

用機械或酶消化方法處理組織器官，使細胞在沒有明顯破損情況下分散為單細胞懸液，進一步分離所需種子細胞。

三維培養(yǎng)的一般方法ForPowerPoint97-2010種子細胞的制備將種子細胞接種到三維支架細胞外基質支架的制備三維培養(yǎng)

靜止性三維細胞培養(yǎng)

方法：把細胞直接種植在三維載體上,體外不施加任何物理方法下進行的培養(yǎng)。

由于重力作用,靜止培養(yǎng)時細胞多聚集到載體的底部和載體之外,載體內部黏附生長的細胞數(shù)量很少,導致載體內部移植細胞數(shù)量的不足。

培養(yǎng)液很難擴散滲透到載體的中心,氧氣、營養(yǎng)物質擴散和代謝物排出受限

影響載體內部細胞的代謝活性

⑤能夠排出更多的CO2,維持生理性pH值,為細胞代謝和功能發(fā)揮提供更有利的微環(huán)境

方法：根據(jù)細胞在自然條件下生長受力情況,在培養(yǎng)過程中適當應用物理方法。

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不僅為細胞生長提供了適宜的生物性微環(huán)境和力學刺激,而且能更好地促進細胞功能的發(fā)揮。①能夠產(chǎn)生有效的、均勻的細胞種植,允許移植最大數(shù)量的細胞②能夠促進載體中黏附生長細胞的增殖,分泌更多細胞外基質,促進組織再生③能夠促進氧氣和營養(yǎng)物質向載體內部輸送④細胞能夠沿著三維載體的孔隙生長,產(chǎn)生具有一定幾何形狀的組織⑥培養(yǎng)液流動能夠對細胞產(chǎn)生機械應力刺激,調節(jié)細胞功能的發(fā)揮。模擬微重力環(huán)境也可以使細胞克服重力影響更容易貼附在微載體表面。

細胞在模擬微重力環(huán)境中有一定程度的三維空間自由，有利于細胞一細胞、細胞一基質之間按組織學特性相互接觸，有利于細胞的增殖和分化

細胞克服重力影響易于聚集，能獲得比在普通重力環(huán)境中更高的細胞培養(yǎng)密度。

低剪切力、高效物質交換的條件為多種細胞和組織塊的生長和代謝提供良好的培養(yǎng)環(huán)境。旋轉培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）重力矢量疊加技術：模擬微重力通過持續(xù)在三維空間改變重力矢量，使細胞沒有足夠時間對這種變化作出反應。

共軸氧合器提供了充分氧合，高效物質交換能力為高密度細胞培養(yǎng)提供良好的培養(yǎng)環(huán)境

TEXT“墨汁”

不同類型的人體活細胞懸浮液TEXT

“紙張”水凝膠（富含糖類和其他營養(yǎng)物質，能夠給生長中的細胞提供營養(yǎng)，且容易去除）TEXT“文章稿件”具備正常功能的人體器官3D打印機的噴頭不僅僅能在平面上移動，還能夠垂直移動。它的打印過程像是將一層層剖面圖疊加在一起，最后制造出一個立體的結構。三維生物打印機三維生物打印機的原型機，技術人員正在試驗打印程序一、計算機輔助設計出該器官的結構藍圖二、將所需細胞精確“打印”到位三、后期處理促進細胞融合和器官成熟技術步驟打印機有兩個噴頭，一個噴涂細胞（黃色），另一個噴涂水溶膠（紅色）以支持和固定細胞，待細胞結構穩(wěn)固后可以將水溶膠移除打印機的噴頭及其作用器官打印的過程骨組織工程支架材料是骨組織工程的核心！！！良好的生物相容性可制備成三維立體結構生物可降解性良好的表面活性可塑性支架材料的要求骨支架材料的分類無機材料復合材料納米材料人工合成支架材料天然骨衍生支架材料有機材料

天然骨

膠原材料

珊瑚骨無機材料◆鈣磷生物陶瓷是目前廣泛應用的骨替代材料◆主要成分為鈣、磷離子,與骨的無機成分相似,它具有良好的生物相容性和骨傳導作用◆其誘導成骨機制是強烈吸附骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、表皮生長因子(EFG)等骨誘導因子有關。◆其存在弱點在于其脆性較大,而且單純HA不易被吸收,因而限制了其在承重部位的應用。Morishita等將骨髓基質干細胞(MSCs)接種于HA支架上,植入骨腫瘤切除后的缺損區(qū)6個月后得以修復。Tan等將自體骨髓與HA復合后植入到綿羊腰椎融合間隙,3個月后見植入體新骨形成并與椎體融合。有機材料

■以聚乳酸(polylacticacid,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolicacid,PGA)、PGA-PLA共聚物為代表●優(yōu)點是可降解性,良好的細胞相容性,容易塑形;●缺點是降解產(chǎn)物為酸性,對微環(huán)境有影響;細胞組織相容性差;機械強度不足;容易引起周圍組織非特異性炎癥反應和免疫反應。納米材料最大的特點為高比表面積和孔隙率,有利于細胞接種、遷移和增殖。在骨組織工程支架材料主要是nHAC。有研究者將nHAC材料負載骨髓基質干細胞修復兔顱骨15mm缺損,實驗表明修復區(qū)無炎癥和排異反應,具有良好的組織相容性,8周時已有較好的新骨組織形成并修復兔的顱骨缺損區(qū)。采用提純并去抗原Ⅰ型膠原為模板,在鈣磷鹽溶液中調制礦化而獲得納米級復合材料,研究結果表明該新型仿生骨材料具有良好的生物相容性,能夠促進和加快骨愈合。復合型材料通過一定的方法將幾種單一材料復合,綜合各種材料優(yōu)缺點,形成復合型支架材料2006年Link等報道,將磷酸鈣骨水泥和PLGA微粒的復合物修復老鼠的顱骨缺損,4周后掃描電鏡及組織學觀察有新骨生成,8周時PLGA微粒完全降解被新骨取代。Chen等將聚乳酸與聚羥基乙酸的共聚物(PLGA)支架浸入適當濃度的膠原溶液中,在PLGA海綿內的孔壁上形成一薄層膠原海綿,可提高材料的親水性及細胞黏附性。天然骨要利用天然骨的無機或有機成分形成的天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)結構為支架,利于成骨細胞粘附、增殖及發(fā)揮成骨作用,并提供寬大的內部空間和表面的微環(huán)境。膠原膠原支架具有良好的生物相容性及適于細胞生長的孔徑,易于營養(yǎng)細胞的大分子通過,且移植前可預先塑形,移植過程能保持適當?shù)臋C械強度,并具有作為細胞生長模板的穩(wěn)定性,因而可做骨組織工程支架材料。珊瑚骨主要成分為碳酸鈣優(yōu)點：骨傳導作用較好,在高孔隙率狀況下仍能保持一定的機械強度,優(yōu)于大多數(shù)人工制備的多孔材料缺點：力學性能較差、降解困難、不易加工。存在問題①支架材料的降解速度與新骨形成速度不協(xié)調;

②支架材料與機體的免疫排斥反應和炎性反應;③材料的表面活性差,影響種子細胞的黏附、分布和功能發(fā)揮;④材料的機械強度與降解速率難以相匹配;⑤材料的生產(chǎn)、存儲等沒有得到一致公認標準等。組織工程骨的臨床運用1、組織工程骨修復牙槽突裂組織工程骨為牙槽突裂骨移植修復提供了較好的骨替代復合物，消除了患者自身骨來源的諸多缺點。2、組織工程骨與口腔種植眾所周知，口腔種植中最大的問題在于頜骨骨量不足，影響種植手術的適應證。研究發(fā)現(xiàn)，將可吸收的聚合物與成骨細胞的復合物植入豬下頜骨的缺損處，采用三維模式觀察骨組織的生長情況，發(fā)現(xiàn)新生骨組織在豬下頜骨缺損處生長良好。Schimming等將下頜骨骨膜分離的成骨細胞種植到高分子聚合物支架上，體外培養(yǎng)2周后，將成骨細胞聚合物復合體移植到上頜骨骨量不足患者的上頜竇底部，以增加該區(qū)域骨質的厚度，術后3個月形成了足夠的新生骨組織，18例患者中12例獲得了成功。Ueda等在種植體獲得初期穩(wěn)定性的前提下，將凝血酶凝膠、富血小板漿、及自體骨髓MSCs構建的可注射組織工程骨注射到種植體骨外部分周圍，術后4~8個月，種植體骨外部分即被鈣化樣組織充滿。牙槽骨高度平均增加5mm。X射線片顯示，新生的類骨組織與種植體緊密結合。負載6個月后，種植體穩(wěn)定性依然良好，且沒有明顯的骨喪失。FilhoCerruti等用同樣的材料用于上頜牙槽骨骨量不足的牙種植患者，結果與Ueda等的報道一致。從以上學者的研究中發(fā)現(xiàn)組織工程骨在口腔種植中存在光明的前景，在一定程度上可以擴大口腔種植的適應證，提高種植術后患者的使用效果。3、組織工程骨植骨臨床應用七年隨訪結果【摘要】目的總結生物衍生組織工程骨植骨I臨床應用的中期效果。方法2000年12月一2001年6月，采用同種異體骨膜來源的成骨細胞1×106／mL與生物衍生骨支架材料構建組織工程骨，經(jīng)體外培養(yǎng)3～7d后，植入修復lO例骨缺損。男6例，女4例；年齡14～70歲，中位年齡42。其中骨囊性病變2例，陳舊性骨折不愈合l例，新鮮粉碎性骨折伴骨缺損6例，慢性化膿性骨髓炎l例。每例患者植入生物衍生組織工程骨量3～15g，平均7．3g。結果10例患者術后傷口均I期愈合。術后獲隨訪7年，除l例于術后1年發(fā)生植骨松動外露取出，以及l(fā)例并發(fā)創(chuàng)傷后肱骨頭壞死取出外，其余植骨均在術后3．0～4．5個月達骨性愈合。x線片檢查：除l例患者已行肱骨頭切除術外，其余均達到骨愈合，骨皮質連續(xù)，重塑良好。患肢功能能滿足日常生活及工作需要。結論生物衍生組織工程骨具有良好的成骨能力，臨床應用中期效果良好，未見明顯排斥反應及并發(fā)癥。組織工程皮膚應用于各種病理情況外科創(chuàng)面

急性切割傷良惡性腫瘤和胎記等切除術后創(chuàng)面的修復大疤性硬斑病切除后缺損難以修復的皮膚病（瘢痕、巨痣、太田痣、文身及一些腫瘤等）大皰性表皮松解癥光化性紫癜

皮膚病敷料真皮復合皮（包含表皮和真皮）皮膚組織工程臨床應用

Biobrane臨時性敷料,用來覆蓋大面積燒傷創(chuàng)面敷料允許創(chuàng)面生理性液體蒸發(fā)可防止蛋白等大分子物質丟失促進表皮再生減小膿毒血癥發(fā)生可以有效地減輕疼痛雙層膜狀物外層薄的硅膠膜內層整合有大量的膠原顆粒，可以迅速與