第1章

發酵工程第2節

微生物的培養技術及應用第3課時

微生物的選擇培養自然界中微生物數量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當要分離的微生物在混合菌群中不是優勢種群時，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實現。雜菌群該怎么辦呢？科學家們應用選擇性培養基解決了這一難題。1、自然界中目的菌株篩選：篩選原因：因為熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數微生物，使耐熱的Taq細菌保留下來。PCR是一種在體外DNA復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（93℃）的DNA聚合酶。耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環境（熱泉、火山口）尋找尋找那么，如何從眾多的微生物中篩選出單一菌種？1973年，科學家從美國黃石國家公園的熱泉中篩選出水生棲熱菌，進而提取出耐高溫的DNA聚合酶?？茖W實例——尋找耐高溫的DNA聚合酶一、選擇培養基美國黃石國家公園的一個熱泉根據微生物對生存環境的要求，到相應環境中去尋找。啟示：被石油污染的土壤冰川凍土層2、實驗室中目的菌株的篩選：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。一、選擇培養基以尿素為唯一氮源的培養基（1）利用營養條件進行選擇培養篩選出能分解尿素的細菌不加含碳有機物的無碳培養基不加氮源的無氮培養基分離固氮菌分離自養型微生物（2）在培養基中加入某種化學物質加入青霉素的培養基加入高濃度食鹽的培養基分離得到酵母菌、霉菌等分離得到金黃色葡萄球菌（3）改變微生物的培養條件無氧環境下培養厭氧型微生物，兼性厭氧型一、選擇培養基篩選出能分解尿素的細菌培養基中加氨芐青霉素具有氨芐青霉素抗性的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌培養基應有菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?實例：一、選擇培養基3、選擇培養基的概念在微生物學中，將允許

生長，同時

或

其他種類微生物生長的培養基稱為選擇培養基。特定種類的微生物抑制阻止思考怎么證明一個選擇培養基具有選擇性呢？應該設置基礎培養基（如牛肉膏蛋白胨培養基）或完全培養基作為對照基礎培養基選擇培養基問題：如果讓你分離土壤中分解尿素的細菌，你應該怎么設計呢？一、選擇培養基4、選擇培養基配方的設計尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學性質穩定，是現代農業生產中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細菌分解成NH3，再被轉化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶，來催化尿素分解。尿素分子模型討論（1）你如何設計培養基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來？培養基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發育繁殖，所以用此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。一、選擇培養基（2）該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml配方一：培養細菌配方二：培養可以分解尿素的細菌①從物理性質看此培養基屬于哪類？從用途上屬于哪類培養基？固體培養基配方二是以尿素作唯一氮源的選擇培養基一、選擇培養基牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml配方一：培養細菌配方二：培養可以分解尿素的細菌②此培養基中共有哪些成分？碳源、氮源、水、無機鹽③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：①提供無機鹽；②調節pH。（2）該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？一、選擇培養基如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細菌，還需對土壤菌液進行稀釋及科學的微生物數量測定方法---稀釋涂布平板法。稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程細菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。1、土壤取樣取土樣時用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。注意二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程（梯度稀釋菌液）

將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無菌水的試管中，依次等比稀釋。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無菌水90mL無菌水10g在火焰旁將10g土樣加入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。2、稀釋土壤樣品二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程測細菌數：一般用104、105、106稀釋液測放線菌：一般用103、104、105稀釋液測真菌數：一般用102、103、104稀釋液選擇一個比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養，以保證能從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數。

在初次實驗中，對于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數在30～300的平板進行計數？問思考·討論二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程微量移液器取0.1mL菌液，滴加到培養基表面。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻8~10s后，再進行涂布。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入恒溫箱培養。3、涂布平板①滴加菌液②涂布器消毒③涂布器滅菌④涂布平板各梯度分別涂布3個平板，1個不涂布作空白對照①每個濃度至少設置4個平板選擇培養基（平行重復）牛肉膏蛋白胨培養基（用以判斷選擇培養基是否具有選擇作用）。②本實驗使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標記。例：標記注明組別、培養日期和平板上培養樣品的稀釋度等。注意二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對照恒溫培養箱待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃恒溫箱中培養1～2d。在涂布有合適菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。4、恒溫培養二、微生物的選擇培養——稀釋涂布平板法的操作流程常用微生物分離方法比較比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具原理特點平板示圖共同點連續劃線梯度稀釋課堂小結接種環涂布器通過接種環在瓊脂固體培養基的表面_________操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。（不能計數）將菌液進行一系列的_________，稀釋度足夠高時，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞。（可計數）方法簡單，但不適宜計數單菌落更易分開，可以計數，但操作復雜使培養基上形成由單個細菌細胞繁殖而來的子細胞群體——菌落選擇培養基鑒別培養基特殊成分目的用途舉例加入某種化學物質抑制其他微生物生長，促進目的微生物的生長加入某種指示劑發生特定顏色反應分離出特定微生物鑒別不同的微生物用尿素作唯一氮源的培養基來篩選尿素分解菌伊紅—美藍培養基鑒定大腸桿菌選擇培養基和鑒別培養基拓展：課堂小結1、某些土壤細菌可將尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。以下說法錯誤的是()A．土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶B．能分解尿素的細菌也能以尿素的分解產物CO2作為碳源C．為了篩選可分解尿素的細菌，在配制培養基時應選擇尿素作為唯一氮源D．篩選分解尿素細菌的培養基含有KH2PO4的作用是提供無機鹽和維持pH2、選擇培養基是根據某一種或某一類微生物的特殊營養要求或對一些物理、化學抗性而設計的培養基。利用這樣培養基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。為選擇酵母菌和硝化細菌，應選用的培養基分別為()A．伊紅美藍培養基、含青霉素培養基B．含青霉素培養基、含氨的無機培養基C．含氨的無機培養基、含青霉素培養基D．含青霉素培養基、伊紅美藍培養基BB課堂練習3、如圖是從土壤中篩選能產脲酶的細菌的過程，下列敘述不正確的是()D課堂練習A.能產生脲酶的細菌可以分解利用尿素B.圖中逐級稀釋的程度會直接影響細菌培養基上的菌落數量C.培養基中可添加KH2PO4、Na2HPO4以提供無機鹽和作為緩沖劑D.培養基①應以尿素為唯一氮源，培養基②的作用是純化培養能產脲酶的細菌2、某些土壤細菌可將尿素[CO(NH2)2]分解為CO2和NH3供植物吸收和利用，但分解物CO2不能為該菌提供營養。下列關于配制分離這一菌種的選擇培養基的成分符合要求的是()A.僅尿素B.尿素+葡萄糖C.僅葡萄糖D.牛肉膏+蛋白胨B1、為培養和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養基中加入（）A.較多的氮源物質B.較多的碳源物質 C.青霉素類藥物