分子生物學課件講第一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第一章緒論第二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第一節分子生物學發展的基礎一、創世說和進化論（一）三個與一切生物學現象有關的問題：生命是怎樣起源的？為什么“有其父必有其子”？動、植物個體是怎樣從一個受精卵發育而來的？第三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）創世說上帝創造了世間萬物，包括人類。（三）達爾文學說1859年達爾文發表了著名的《物種起源》一書，提出了進化論學說。其進化論思想的精髓可概括為“物競天擇，適者生存”幾個字。他認為世界上的一切生物都是可變的，物種的變異是由于大自然的環境和生物群體的生存競爭造成的。第四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、細胞學說的建立十七世紀末十八世紀初，荷蘭的Leeuwenhoek制作了世界上第一臺顯微鏡，并觀察了諸多生物樣本。大約與其同時代的Hooke第一個提出“細胞”一詞。第五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日十九世紀，德國植物學家Schleiden和動物學家Schwann建立了細胞學說。他們認為：所有組織的最基本單元是形狀非常相似而又高度分化的細胞。細胞的發生和形成是生物界普遍和永久的規律。第六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、經典的生物化學和遺傳學進化論和細胞學說的結合，產生了現代生物學。而以研究動、植物遺傳變異規律為目標的遺傳學和以分離純化、鑒定細胞內含物質為目標的生物化學則是這一學科的兩大支柱。第七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（一）經典的生物化學的成就十九世紀，人們就已經發現了蛋白質。到二十世紀初，組成蛋白質的20種氨基酸被相繼發現。Fisher還論證了連接相鄰氨基酸的“肽鍵”的形成。細胞的其他成分，如脂類、糖類和核酸也相繼被認識和部分純化。第八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1869年，Misescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離到DNA。1910年，德國科學家Kossel首先分離得到了腺嘌呤、胸腺嘧啶和組氨酸。第九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）經典遺傳學的建立和發展1865年，奧地利科學家孟德爾（GregorMendel）發表了《植物雜交試驗》一書，提出了遺傳學的兩條基本規律：統一律和分離律。他認為：生物的每一種性狀都是由遺傳因子控制的，這些因子可以從親代到子代，代代相傳。第十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1909年，丹麥遺傳學家W.Johannsen首先使用“基因”一詞。第十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二十世紀初，美國遺傳學家Morgan提出了基因學說。他指出：種質必須由獨立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子，或者簡單地稱為基因。第十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日Morgan及其助手發現了連鎖遺傳規律，并且第一次將代表某一性狀的基因，同某一特定的染色體聯系起來。第十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二節分子生物學發展簡史分子生物學的定義：是研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學。第十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1928年英國科學家Griffith等人發現肺炎鏈球菌可以引起肺炎，導致小鼠死亡。1944年美國微生物學家Avery通過肺炎鏈球菌對小鼠的感染實驗，證明DNA是遺傳信息的載體。第十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1953年Watson和Crick提出DNA右手雙螺旋模型，于1962年和Wilkins共享諾貝爾生理醫學獎。同年，Sanger首次闡明了胰島素的一級結構，開創了蛋白質序列分析的先河，他于1958年獲諾貝爾化學獎。第十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1954年Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。1958年，Meselson和Stahl提出了DNA的半保留復制。第十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1961年，法國科學家Jacob和Monod提出了調節基因表達的操縱元（operon）模型，1965年獲得諾貝爾生理醫學獎。他們還首次提出了信使核糖酸（mRNA）的存在及作用。同年，Nirenberg等人應用合成的mRNA分子[poly(U)]破譯出第一批遺傳密碼。第十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1966年，美國科學家Nirenberg等人破譯了全部的DNA遺傳密碼，1969年與Holley和Khorana分享了諾貝爾生理醫學獎。1967年發現了可將DNA連接起來的DNA連接酶。第十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1970年Smith、Qilcox及Kelley分離到第一種可以在DNA特定位點將DNA分子切開的限制性核酸內切酶。同年，美國的Temin和Baltimore發現RNA腫瘤病毒中存在逆轉錄酶，他們于1975年共享諾貝爾生理學獎。第二十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1972年，Berg、Boyer等人第一次成功地完成了DNA重組實驗。1974年，首次實現了異源真核生物的基因在大腸桿菌中的表達。第二十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1975~1977年，美國人Sanger和Gilbert發明了快速DNA序列測定技術，并于1977年完成了噬菌體ΦX174基因組（5386bp）的序列測定。1980年Sanger和Gilbert與Berg分享了諾貝爾化學獎。第二十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1982年Prusiner提出“感染性蛋白質顆粒”的存在；次年將這種蛋白顆粒命名為阮病毒蛋白（prionprotein,PrP）。1997年，Prusiner因為發現朊病毒而獲得諾貝爾生理醫學獎。第二十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1984年，德國人Kohler、美國人Milstein和丹麥科學家Jern由于發展了單克隆抗體技術而分享了諾貝爾生理醫學獎。第二十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1986年，Mullis發明了PCR技術。1993年Mullis與第一個設計定點突變的Smith共享了諾貝爾化學獎。第二十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1988年Waston出任“人類基因組計劃”首席科學家，舉世矚目的人類基因組測序工作開始啟動。第二十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1993年，美國科學家Roberts和Sharp由于在不連續基因方面的工作而獲得諾貝爾生理醫學獎。第二十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1996年，酵母基因組DNA的全部序列測定工作完成。2000年6月26日，人類基因組工作框架圖繪制完成第二十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第三節人類基因組計劃

（HumanGenomeProject，HGP）第二十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日一、問題的提出70年代對人類基因組的研究已具有一定的雛形；

1986年著名遺傳學家MckusickV提出從整個基因組的層次研究遺傳學的科學稱“基因組學”；第三十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日同年，諾貝爾獎獲得者Dulbecco

R在Science雜志上發表了題為“癌癥研究的轉折點——人類基因組的全序列分析”，得到了世界范圍的響應；1986年美國能源部宣布實施這一草案；第三十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1987年美國能源部（DOE）和國家健康研究院（NIH）為HGP下拔了經費1.66億美元，開始籌建HGP實驗室；第三十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1988美國成立了“國家人類基因組研究中心”由諾貝爾獎獲得者WatsonJ出任第一任主任。第三十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、世界的行動1987年，意大利的國家研究委員會（NRC）組織了15個（后來發展到30個）實驗室，開始HGP的研究；1989年2月，英國的HGP開始啟動;第三十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1990年6月，法國的國家HGP開始啟動；同月，歐共體通過了“歐洲HGP研究計劃”，主要資助23個實驗室；1990年10月1日美國國會正式批準美國的“HGP”啟動，計劃在15年內投入至少30億美元進行人類全基因組的分析；第三十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1994年初，在吳旻、強伯勤、陳竺院士和楊煥明教授的倡導下，中國的HGP開始啟動；1998國家科技部在上海成立了中國南方基因中心，由陳竺院士掛帥；1998年~1999年成立了中國科學院北京人類基因組中心和北方人類基因組中心，由中科院遺傳所的楊煥明教授，強伯勤院士等人牽頭；第三十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1995年6月，德國正式開始HGP。第三十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、任務與進展（一）遺傳圖譜（geneticmap)：１，定義又稱連鎖圖譜（linkagemap)或遺傳連鎖圖譜（geneticlinkagemap)，是指人類基因組內基因以及專一的多態性DNA標記(marker)相對位置的圖譜，其研究經歷了從經典的遺傳圖譜到現代遺傳圖譜的過程。第三十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日２，經典的遺傳圖譜（以基因表型為標記）３，現代遺傳圖譜（以DNA為標記）第一代多態性標記：限制性片段長度多態性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)，位點數目可達105以上。第三十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二代多態性標記：小衛星/可變數量串聯重復（minisatellite

/variablenumbertandemrepeat,VNTR)

及微衛星/簡短串聯重復（microsatellite/simpletandemrepeat,STR)。個數在6000個以上。其中STR具高度多態性，有的可形成幾十種等位片段，是目前在基因定位的研究中應用最多的標記系統。第四十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第三代多態性標記：單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)。這種標記在人類基因組中多達300萬個。第四十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日４，構建遺傳圖譜的基本原理：真核生物在減數分裂過程中染色體進行重組和交換，染色體上任意兩點之間發生重組和交換的概率隨著兩點之間相對距離的遠近而發生變化。第四十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日５，構建遺傳圖譜的意義：通過連鎖分析，可以找到某一致病基因或表型的基因與某一標記鄰近（即緊密連鎖）的證據，從而可把這一基因定位于染色體的特定區域，再對基因進行分離和研究。第四十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）物理圖譜（physicalmap):：１，定義用物理學方法構建的由不同的DNA結構按其在染色體上的原始順序和實際距離排列的圖譜。第四十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日２，內容基因組的細胞遺傳學圖（cytogeneticmap，即染色體的區、帶、亞帶）；序列標簽位點(sequence-taggedsite,

STS)圖譜；第四十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日DNA“重疊群(contig)”圖譜：把基因組文庫中含有相同STS序列的DNA克隆按照其在原始基因組上線形順序進行排列，連接成相互重疊的“片段重疊群(contig)”。是構建物理圖譜的主要任務；第四十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日大片段限制性內切酶切點圖；cDNA/EST圖譜；基因組中廣泛存在的特征性序列（如CpG序列、Alu序列等）的標記圖等。第四十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）序列圖譜：2003年之前完成。（四）基因圖譜：目標：在人類基因組中鑒別出全部基因的位置、結構和功能；第四十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日定位方法：cDNA/EST的染色體定位（實驗手段，電子雜交）；完成時間：200？年完成。第四十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（五）模式生物基因組：酵母1996年大腸肝菌1997年線蟲1999年果蠅2000年擬南芥菜2000年小鼠2005年之前完成第五十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第四節

分子生物學的研究內容第五十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日一、DNA重組技術（基因工程）（一）DNA重組技術的含義：指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，并將之導入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，從而使接受者產生新的遺傳性狀的技術。第五十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日關鍵技術：限制性內切酶、DNA連接酶及其他工具酶的發現和應用。（二）DNA重組技術的建立第五十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）DNA重組技術的應用可用于大量生產某些在正常細胞代謝中產量很低的多肽；可用于定向改造某些生物基因組結構可用于基礎研究第五十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、基因表達調控研究生物個體在生長發育過程中，基因表達是按一定的時序發生變化（時序調節），并隨著內外環境的變化而不斷加以修正（環境調控）的。基因表達調控研究的主要方面有：第五十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（一）信號轉導（singnaltransduction)研究信號轉導：指外部信號通過細胞膜上的受體傳到細胞內部，并激發諸如離子通透性、細胞形狀或其他細胞功能方面的應答過程。第五十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）轉錄因子研究轉錄因子：是指一群能與基因5‘端上游特定序列專一結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。（三）RNA剪接研究第五十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、生物大分子結構功能研究（又稱結構分子生物學）（一）概念：是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。第五十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）結構分子生物學的研究方向：結構測定；結構運動變化規律；結構與功能關系的建立。第五十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）結構分子生物學的研究手段物理和化學手段：Ｘ射線衍射的晶體學（蛋白質晶體學）；二維和多維核磁共振；電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學方法；化學合成；分子生物學手段第六十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第五節

分子生物學的展望第六十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日對神經生物學的影響對遺傳學的影響對分類和進化研究的影響對發育生物學的影響對現代醫學的影響其他一、分子生物學對生命科學各個領域的滲透第六十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日

統一生物學（generalbiology)：生物學范疇內所有學科在分子水平上的統一。第六十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、人類基因組計劃的延伸

——人類后基因組（功能基因組）研究第六十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（一）蛋白質組（proteome）和蛋白質組學（proteomics)１，蛋白質組：由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應的蛋白質。２，蛋白質組的動態性第六十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（1）原因：同一個機體的不同組織和不同細胞；在同一機體的不同發育階段；機體的生理狀況；機體所處的外界環境。（2）結果：基因mRNA表達種類的改變；基因表達的不同形式（基因剪接，蛋白質翻譯修飾，蛋白質剪接等）。第六十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日測定一個有機體的基因組所表達的全部蛋白質。3，蛋白質組學的任務：第六十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）后基因組研究的研究內容：人類基因組多樣性計劃（HumanGenomeDiversityProject）環境基因組學（EnviromentalGenomics）腫瘤基因組解剖計劃（CancerGenomeAnatomyProject）藥物基因組學（Pharmacogenomics）第六十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日核心問題：基因組的多樣性；遺傳疾病產生的起因；基因的表達調控作用；蛋白質產物的功能。第六十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二章遺傳的物質基礎第七十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第一節遺傳物質的本質一、DNA是遺傳物質（一）、DNA是遺傳物質的證明第七十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1928年Griffith等進行的肺炎球菌轉化（transformation）實驗1944年Avery證明DNA是遺傳物質第七十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）DNA攜帶兩類不同的遺傳信息1，負責基因結構的信息2，負責基因選擇性表達的信息第七十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、RNA也可作為遺傳物質（一）RNA病毒病毒顆粒（viron）：由病毒RNA基因組和包被在外的蛋白質外殼組成病毒的生存方式：病毒編碼包裝基因組所需的蛋白，以及一些在感染循環中復制病毒所需的蛋白質。其他蛋白質由宿主提供。因此病毒不能獨立生存。第七十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）類病毒（viroid）類病毒:是使高等植物產生疾病的有傳染性的因子，由很小的環狀RNA分子構成。與病毒不同，類病毒的RNA本身就是感染因子。類病毒只由RNA組成，其中廣泛存在不完全的堿基配對，形成一種特有的棒狀結構。類病毒的基因組不能編碼蛋白質。第七十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日類病毒的復制：必須由宿主的酶來完成，其RNA作為模板。類病毒對宿主的影響：類病毒可通過復制占有宿主細胞中關鍵的酶，從而影響宿主細胞的正常功能；類病毒也能影響必需的RNA的產生而引發疾病；它們還可以作為一個不正常的調控分子，對個別基因的表達產生特殊的影響。第七十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、是否存在核酸之外的遺傳物質？（一）朊病毒（prion）：是一個28KDa的疏水性糖蛋白，由細胞的核基因編碼，在正常動物的腦組織中有表達。（二）朊病毒的存在形式：朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感染性形式（PrPC）兩種形式存。第七十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）兩種形式的朊病毒的異同：

PrPC

PrPSC功能：不詳導致退行性神經疾病分布：正常腦被感染腦抗蛋白酶性：可被完全降解只能被部分降解溶解性：可溶難溶一級結構：兩者相同二級結構：40%螺旋20%螺旋，50%折疊第七十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（四）朊病毒的感染方式PrPSC

作用需要PrPC

的參與PrPSC

蛋白的錯誤折疊形式可以催化天然PrPC分子從正常的可溶性的螺旋構象向不溶性的折疊構象轉化，最終導致了疾病和感染。第七十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（五）朊病毒的多株現象不同PrPSC株可使一種PrP結構轉化為不同的構型；而同一種PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多種生物中傳代，即使經過多次傳代仍然保持自身的生物學特征。（六）朊病毒是遺傳物質嗎？多株現象難以解釋其感染方式能否被視為遺傳復制？第八十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二節DNA的一級結構一、DNA一級結構的組成一級結構：4種核苷酸的連接及其排列順序(一）含氮堿基（nitrogenousbases）第八十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日DNA中的常見堿基有：胞嘧啶（cytosine,C）、胸腺嘧啶（thymine,T）、腺嘌呤（adenine,A）和鳥嘌呤（guanine,G）第八十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）脫氧核糖核苷（nucleoside）由堿基和戊糖（D-脫氧核糖）縮合而成。有4種脫氧核糖核苷：胞嘧啶脫氧核糖核苷、胸腺嘧啶脫氧核糖核苷、腺嘌呤脫氧核糖核苷）和鳥嘌呤脫氧核糖核苷++H2O第八十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）脫氧核糖核苷和磷酸縮合形成的磷酸酯第八十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日所有的核苷酸的5’位置可以連接一個以上的磷酸基團。從戊糖開始的第一、二、三個磷酸殘基依次稱為α、β、γ核苷三磷酸縮寫為NTP，核苷二磷酸縮寫為NDP。第八十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（四）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）脫氧核糖核苷酸以3’，5’磷酸二酯鍵聚合成為脫氧核糖核酸（DNA）鏈。鏈的一端的核苷酸有自由的5’磷酸基團，稱5’端；另一端核苷酸具有自由的3’羥基，稱3’端第八十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日DNA鏈的方向就是從5’端到3’端。DNA分子通常以線性或環狀的形式存在。大多數DNA由兩條互補的單鏈構成。少數生物的DNA，如某些噬菌體或病毒是以單鏈形式存在的。第八十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、DNA的堿穩定性DNA對堿相對穩定RNA在堿性溶液中易降解為2’，3’環式單核苷酸中間產物，然后很快轉變為2’

單核苷酸和3’單核苷酸。第八十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、序列測定方法（一）小片段重疊法（二）凝膠直讀法1，酶法（1）加減法（Sanger,1975）（2）末端終止法(雙脫氧法/間接拷貝法)（Sanger,1977）第八十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日末端終止法的應用——循環測序（cyclesequecing)實驗及原理a.測序反應的設定體系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，4種dNTP和熒光ddNTP（4種熒光）等；b.反應包括：DNA變性，引物與模板配對，DNA聚合酶使引物延伸（在引物3’末端接上dNTP或ddNTP）；c.反應的終止20-30個循環后，新合成所有可能的DNA片段，每個片段的3’末端都被接上ddNTP，延伸終止；d.反應產物電泳分離及檢測在聚丙烯凝膠中，不同大小的DNA片段在高壓電場作用下遷移，小分子遷移速度快，先被位于凝膠底部的裝置檢測到。e.結果的處理及輸出根據被檢測到的DNA片段的順序及顏色，繪出DNA片段的電泳圖譜。DNA序列中的每個核苷酸由一系列按順序排列的彩色峰型顯示出來第九十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，化學法（Maxam/Gilbert,1977）適用于DNA短片段的測定四、一級結構的重要性攜帶遺傳信息決定DNA的二級結構決定DNA的空間結構第九十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二節DNA的二級結構一、DNA螺旋的幾種構象及其動態平衡（一）Watson–Crick右手雙螺旋結構（B-DNA構象）相對濕度為92%時，DNA鈉鹽纖維為B-DNA構象。在天然情況下，絕大多數DNA以B構象存在。1，主鏈:2，堿基對3，螺距4，大溝和小溝第九十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）A-DNA構象為相對濕度改變（75%以下）或由鈉鹽變為鉀鹽、銫鹽，DNA的結構可成為A構象。它是B-DNA螺旋擰得更緊的狀態。DNA-RNA雜交分子、RNA-RAN雙連分子均采取A構象。第九十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）Z-DNA構象在一定的條件下（如高鹽濃度），DNA可能出現Z構象。Z-DNA是左手雙螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大溝，小溝窄而深，并具有更多的負電荷密度。第九十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日B-DNA、A-DNA及Z-DNA結構特征比較

B-DNAA-DNAZ-DNA每圈bp數10-10.61112每bp轉角（度）+34.6+34.7-30每bp上升距離（A）3.382.565.71螺旋直徑（A）192318第九十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日B-DNA是活性最高的DNA構象，B-DNA變成A-DNA后，仍有活性，但若局部變構為Z-DNA后，活性明顯降低。第九十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、決定雙螺旋結構狀態的因素（一）氫鍵1，堿基的氫供體氨基、羥基2，堿基的氫受體酮基、亞氨基3，G·C對及A·T對之間的氫鍵在一定范圍內DNA的穩定性與G·C百分含量成正比（圖1-2）第九十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日4，氫鍵數對DNA雙鏈穩定性的影響5，堿基之間形成氫鍵的條件互補性方向性第九十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）堿基堆集力1，堿基堆集力同一條鏈中的相鄰堿基之間的非特異性作用力2，堿基堆集力的來源疏水作用累積的VanderWaal的作用力3，堿基堆集作用的證據單鏈多核苷酸傾向于堿基平行排列的規則螺線結構破壞疏水作用和雙鏈的氫鍵可降低DNA的穩定性第九十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）帶電荷的磷酸基的靜電斥力磷酸集團的負電對DNA雙鏈的穩定性起負作用。陽離子可對之產生屏蔽。DNA溶液的離子濃度越低，DNA越不穩定。（四）堿基分子內能堿基內能越高，氫鍵和堿基堆積力越容易被破壞，DNA雙鏈越不穩定第一百頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第三節DNA的高級結構一、正超螺旋和負超螺旋（一）形成超螺旋的原因和條件原因：因某種原因引入了額外的螺旋條件：a,DNA雙螺旋閉合或被蛋白結合，末端不能自由轉動；b,DNA雙鏈上無斷裂（二）正超螺旋（二）負超螺旋第一百零一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、描述DNA螺旋狀態的帶子模型(一）L=T+W1，L：連接數（linkingnumber）；specifiesthenumberoftimesthatthetwostrandsofthedoublehelixofaclosedmoleculecrosseachotherintoto.2，T：初級螺旋數（twistingnumber）；representstherotationofonestrandabouttheother.3，W：超螺旋數（writhingnumber）；representstheturningoftheasisoftheduplexinspace.第一百零二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日有相同的一級結構，而L值不同的DNA分子叫做拓撲異構體。在DNA雙鏈不發生斷裂的前提下，L值不變。（二）⊿L=⊿W+⊿T（三）比連接差（specificlinkingdifference)；1，表達式：=（L-L0）/L0（L0：表示松弛環型DNA）2，含義：用來表示超螺旋的程度；當初級螺旋數不變時，代表超螺旋密度。第一百零三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、影響DNA高級結構的酶L值的改變需要至少一條DNA鏈斷裂一次。斷裂造成的DNA自由末段的一斷可繞著另一端旋轉，隨后被重新連接，DNA拓撲異構酶通過催化此類反應將DNA從一種拓撲結構轉變成另一種。第一百零四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（一）I型DNA拓撲異構酶（圖1-25）底物：DNA單鏈ATP：不需酶活性：DNA內切酶和連接酶活性代表：E.Coli的DNA拓撲異構酶I：可催化負超螺旋DNA轉化為松弛環型

鼠DNA拓撲異構酶I：對正、負超螺旋有相同的松弛能力第一百零五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日原理：E.coli拓撲異構酶識別部分解螺旋的DNA分子，與DNA單鏈部分結合后，切斷一條鏈，并以其酪氨酸殘基與DNA的5’磷酸相連。磷酸二酯鍵從DNA轉移蛋白質上。酶將完整的DNA鏈拉過缺口后（⊿L=+1），重新連接原先單鏈上磷酸二酯鍵。第一百零六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日上述過程除了改變DNA的超螺旋結構外，還可使單鏈環狀分子形成三葉結構，以及使兩個單鏈環狀分子成為環連體分子。（圖1-24）第一百零七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）II型DNA拓撲異構酶底物DNA雙鏈ATP需要酶活性DNA內切酶和連接酶活性代表E.Coli旋轉酶（DNAgyrase,DNA拓撲異構酶II），可引入負超螺旋。無ATP時，此酶只能緩慢地松弛負超螺旋。第一百零八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日E.Coli的旋轉酶還具有形成和拆開雙鏈DNA環連體和成結分子的能力。此類酶無堿基序列特異性。第一百零九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（三）DNA拓撲異構酶催化反應的實質：其本質是先切斷DNA的磷酸二酯鍵，改變DNA的鏈環數后再連接，兼具DNA內切酶和DNA連接酶的功能。然而這些酶并不能連接事先已經存在的斷裂DNA，即其斷裂及連接反應是相互偶聯的。第一百一十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第四節DNA的變性、復性、

雜交和Cot曲線一、DNA的變性DNA變性（熔解）：DNA被加熱或某些試劑的作用下，配對堿基之間氫鍵和相鄰堿基之間的堆集力受到破壞，逐步變為近似于無規則的線團構型即變性DNA的過程。第一百一十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（一）單、雙鏈DNA的紫外光吸收雙鏈DNA：A260=1.0時，50μg/ml單鏈DNA：A260=1.0時，33μg/ml（單鏈RNA：A260=1.0時，40μg/ml）第一百一十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）DNA的熔解曲線1，Tm值：緩慢而均勻地DNA溶液的溫度，當A260增加到最大增值的一半時的溫度，叫做DNA的熔解溫度或熔點，用Tm表示。2，計算Tm值的經驗公式在0.15mol/LNaCl+0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中，當DNA長鏈G+C百分含量在30%~70%時

Tm=69.3+0.41（G+C）%當DNA鏈長度為14~70nt時

Tm=81.5+16.6lg[Na+]+0.41（G+C）%-0.6×甲酰胺%-600/L-1.5×錯配%當DNA鏈長度≦18nt時，可近似認為

Tm=4（G+C）+2（A+T）第一百一十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、復性DNA復性：變性DNA在一定條件下恢復天然DNA的結構的過程。（一）復性的條件1，消除磷酸基的靜電斥力；2，破壞連內氫鍵（二）復性的機制1，隨機碰撞取決于DNA濃度、溶液溫度、離子強度等2，成核作用（nucleation)3，拉拉鏈作用（zippering）第一百一十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、雜交重要的雜交技術：SouthernBlottingNorthernBlotting第一百一十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日3.InSituHybridization第一百一十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日

4.ColonyHybridization第一百一十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日四、Cot曲線（一）DNA復性的動力學1，單鏈消失的速度：-dc/dt=kc2

C/Co=1/(1+kCot)k：為二級反應常數（單位：L/mol秒），受DNA分子序列的復雜性、陽離子濃度、溫度的影響C:單鏈DNA的濃度（核苷酸摩爾數/L）第一百一十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日當C=1/2C0(即DNA復性一半）時Cot（Cot?）=1/k

DNA分子序列的復雜性X：最長的沒重復序列的核苷酸對的數值。Cot?

X

：在DNA總濃度相同的情況下，X值越小，片段濃度越高，復性時間越短，Cot?

越小。X=KCot?（影響K值的因素：陽離子濃度、溫度、片段大小）第一百一十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，Cot曲線不同物種核酸的Cot曲線第一百二十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日3，原核生物DNA的復性動力學（圖1-10）原核生物Cot曲線形狀：不同生物曲線形狀相似，都是單一序列；原核生物Cot曲線跨度：一般只有兩個數量級；原核生物Cot曲線位置：基因組越大越靠右。第一百二十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日4，真核生物DNA復性動力學（1）真核生物的DNA復性曲線（圖2-8）真核生物Cot曲線特點：階梯狀，跨度7-8個數量級。真核生物Cot曲線的組成：快復性組分/中間復性組分/慢復性組分第一百二十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（2）3種復性組分復雜性的計算X=KC0t1/2每種復性成分的實際C0t?值=測得的C0t?值該組分占總DNA的百分比待測樣品DNA的復雜長度

=標準DNA的復雜長度待測樣品DNACot?

/標準DNACot?第一百二十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日化學復雜長度和動力學復雜長度化學復雜長度：通過化學方法測量得到的DNA長度動力學復雜長度：按照復性動力學計算出來的DNA復雜長度基因組的化學復雜長度單一序列的動力學復雜長度/單一序列的百分比第一百二十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（3）每一組分拷貝數（重復頻率）的計算重復頻率f=化學復雜長度/動力學復雜長度=（基因組化學復雜度標準DNAC0t?）/（待測DNA樣品C0t?

標準DNA樣品動力學復雜長度）第一百二十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（4）同一復性曲線各組分的Cot?與重復頻率的關系C0t?（1）：C0t?（2）=f（2）：f（1）f（2）=f（1）

[C0t?（1）/C0t?（2）]第一百二十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第三章

基因與基因組

第一百二十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日一、基因概念的歷史演變1909年W.Johannsen首先使用“基因”一詞，其含義與孟德爾的“遺傳因子”完全一致。此階段基因只是邏輯推理的產物。第一節基因第一百二十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日20世紀初，T,H.Morgan等人提出連鎖交換規律和伴性遺傳，指出基因在染色體上直線排列。1926年Morgan在《基因論》中指出基因代表著一個有機的化學實體。第一百二十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1941年Beade和Tatum提出了“一個基因一個酶（

onegene:oneenzymehypothesis

）”的假說，認為：基因是一個DNA片段，負責編碼一個蛋白酶（蛋白質）。當一種蛋白質是由異源亞基構成時，該假說應修正為“一個基因一條多肽鏈”。第一百三十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日1955年，S.Benzer提出了順反子（cistron），突變子（muton）和重組子（recon）等術語。順反子學說認為，順反子是一段編碼一種多肽鏈的核苷酸序列，是一個功能單位。該學說否定了基因是決定遺傳形狀的功能單位，同時也是突變和重組的最小單位的看法。而突變子和重組子最終被證明是以單核苷酸對為單位的。第一百三十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日目前對基因的認識是：基因是能夠表達和產生基因產物（蛋白質或RNA）的核苷酸序列。其內容可擴展至包括兩側對基因表達的起始和終止所必需的調控序列。第一百三十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日Gene(cistron)isthesegmentofDNAinvolvedinproducingapolypeptidechain;itincludesregionsprecedingandfollowingthecodingregion(leaderandtrailer)aswellasinterveningsequences(introns)betweenindividualcodingsegments(exons).第一百三十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、基因的現代概念1，轉座成分（transposableelements）又叫做移動基因（movablegenes）是一些可以在染色體基因組上從一個位置轉移到另一個位置，甚至在不同染色體之間躍遷的DNA成分。有人將之形象地稱為跳躍基因（jumpinggenes）。第一百三十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日跳躍基因是由美國女科學家B.McClintock于上個世紀的40年代后期在玉米中首先發現的。當時稱為激活-解離因子（activator-dissociationelement，即Ac/Ds因子）。（P449）第一百三十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，斷裂基因（splitinggene）真核基因的核苷酸序列中間有與氨基酸編碼無關的DNA間隔區，使一個基因分隔成不連續的若干區段。這種編碼序列不連續的間斷基因稱為斷裂基因。現已證實，除了真核生物外，少數原核生物，如大腸桿菌T4噬菌體中也存在斷裂基因。第一百三十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第一百三十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日3，假基因（pseudogene）是一些核苷酸序列與其相應的正常功能基因基本相同、但卻不能合成出功能蛋白質的失活基因，通常積累了較多的突變。現已在大多數真核生物中發現了假基因的存在。假基因數量一般較少。第一百三十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日4，重疊基因不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的，即這些基因的核苷酸序列是彼此重疊的，這樣的基因稱為重疊基因（overlappinggenes）或嵌套基因（nestedgenes）。目前已在病毒、噬菌體和少數真核基因中發現了重疊基因。第一百三十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、基因的分類基因按其產物的功能可分為結構基因、調控基因和RNA基因：1，結構基因：可被轉錄形成mRNA，并進而翻譯成多肽，構成各種結構蛋白質，催化各種生化反應的酶和激素等；第一百四十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，調控基因：指某些可調節控制結構基因表達的基因。3，RNA基因：是一些只轉錄不翻譯的基因，包括核糖體RNA基因，專門轉錄rRNA；以及tRNA基因，專門轉錄tRNA。第一百四十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第二節

原核生物的基因組第一百四十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日一、大腸桿菌（E.coli）的染色體及其基因（一）E.coli的染色體類核：大腸桿菌中可有2-4個DNA相對集中的區域，即類核第一百四十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日染色體結構：E.coli的染色體DNA是一個由4.2X106堿基對組成的雙鏈環狀分子。多種DNA結合蛋白和RNA可使染色體壓縮成一個腳手架（scaffold)結構,分成大約100個小區（domain）（圖2-2）。第一百四十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）E.coli的基因組的特點1，功能相關的結構基因通常構成操縱元操縱元（operon）：大腸桿菌功能上相關的幾個結構基因前后相連，由一個共同的調節基因和一組共同的控制位點，即啟動子（promoter）和操作子（operator）對其表達過程實行協同調節控制。細菌基因表達調控的這樣一個完整的單元，稱為操縱元第一百四十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第一百四十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日調控元（regulon）：幾個操縱元和它們共同的調節基因所構成的基因表達調控單元2，蛋白質基因通常以單拷貝形式存在3，RNA基因通常是多拷貝的大多數大腸桿菌菌株都有7個核糖體基因（rrn）操縱元，多數rrn操縱元分布在DNA復制起始位點附近4，其他基因的調控形式多樣第一百四十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日二、噬菌體

174的基因組及其基因（一）

174噬菌體概況20面體，無尾。其DNA為單鏈環狀，含5386個堿基。第一百四十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）

174基因組的特點1，有11個基因，分別從基因A、B、D開始轉錄成3個mRNA2，非編碼區DNA占基因組的4%第一百四十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日3，有重疊基因和基因內基因基因內基因：B在A*內，E在D內；部分重疊的基因：K和C只有一個堿基對重疊的基因：D的終止密碼的最后一個堿基是J起始的第一個堿基，兩者ORF不同第一百五十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日三、

噬菌體的基因組及其基因（一）噬菌體的概況1，一般情況染色體DNA為雙鏈，共有48502個堿基對。在不同的生長狀態下，噬菌體DNA可以以環狀分子（帶切刻），和線形分子（具有兩個粘性末端）兩種形式存在（圖2-6）第一百五十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，噬菌體的生活史（1）溶菌（裂解）周期（lyticcycle）基本過程：吸附：噬菌體吸附到細菌表面的特殊接受器上注入：噬菌體DNA穿過細胞壁注入寄主細胞轉變：被感染細菌功能發生變化，成為制造噬菌體的場所第一百五十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日合成：寄主細胞大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質組裝：噬菌體DNA包裝頭部和尾部蛋白，成為噬菌體顆粒釋放：新合成的子代噬菌體顆粒從寄主細胞內釋放出來第一百五十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日噬菌體溶菌（裂解）周期（lyticcycle）基本過程第一百五十四頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（2）溶原周期（lysogeniccycle）溶原化（lysogenization）：噬菌體以環狀分子存在于寄主的細胞質中，或整合到寄主的染色體上，并與寄主染色體一起復制，這種狀態稱為溶原化第一百五十五頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日溶原性細菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌體基因組的細菌原噬菌體(prophage）：在溶原性細菌內存在的整合的或非整合的噬菌體DNA超感染免疫性（immnitry）：溶原性細菌可以抗御同種噬菌體再感染的特性第一百五十六頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日溶原菌的誘發（induction）：溶原菌因某種原因進入溶菌周期的現象。在誘發過程中，噬菌體基因組以單一DNA片段的形式從寄主染色體DNA上刪除下來，然后環化成環形DNA分子第一百五十七頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日噬菌體的生活史第一百五十八頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（二）噬菌體的基因組1，基因簇噬菌體的基因除N和Q兩個基因外，其余是按功能的相似性聚集成簇的。例如頭部、尾部、復制及重組四大功能的基因各自聚集成4個基因簇第一百五十九頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日2，噬菌體的基因組分區（1）左側區：自基因A到J，包括參與噬菌體頭部及尾部蛋白質合成的全部基因第一百六十頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（2）中間區：介于基因J和N之間，占全基因組30%。部分基因與細菌整合到寄主DNA上和溶源生長有關。這部分的基因不是噬菌體裂解生長所必需的，用其他外源DNA片段代替該區域對噬菌體的感染和生長都不會有嚴重影響。第一百六十一頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日（3）右側區：位于N基因的右側，包括主要的調控成分、噬菌體的復制基因（O和P）以及溶菌基因（S和R）

第一百六十二頁，共一百八十一頁，2022年，8月28日第三節真核生物的基因組一、基因組大小和C值矛盾（一）C值1，概念：一個物種的單倍體基因組的全部DNA含量2，C值與物種進化的關系低等真核生物中，C值與物種的結構和功能復雜性之間呈正相關；在高等真核生物中兩者間的關系變得模糊不清第一百六十三頁，共一百八十一頁，2022年，8月2