中南大學湘雅醫學院醫學院檢驗系臨床微生物學免疫學教研室結核分枝桿菌李聞文，教授2013，4第十四章結核分枝桿菌屬

目的要求：1、了解分枝桿菌的概述。2、掌握結核分枝桿菌的特點。3、掌握檢驗程序及檢驗方法。4、了解麻風分枝桿菌。第一節命名與分類

現已發現100余種，除結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌外，其它統稱為非典型分枝桿菌。本菌屬細菌為略帶彎曲的需氧菌，繁殖時呈分枝狀生長，故名。G+菌，無鞭毛，無莢膜，無芽胞，不產生內、外毒素。本菌屬含脂類多，尤其是細胞壁，占干重的60%。是一類細長略帶彎曲的桿菌，有分枝生長的趨勢，具有抗酸性，即一般染色細菌不易著色，經加溫或延長時間才能著色，一旦著色后能抵抗鹽酸酒精的脫色作用，又稱抗酸桿菌。上世紀末國際上多數學者認為分類如下：1．典型結核分枝桿菌又稱結核菌群（1）人型結核分枝桿菌，標準人型強毒株（H37Rv），標準人型無毒株（H37Ra）（2）牛分枝桿菌（3）田鼠分枝桿菌

2．非典型分枝桿菌又稱非結核分枝桿菌，又分為Ⅰ光產色菌，Ⅱ暗產色菌，Ⅲ不產色菌，Ⅳ快速生長型。

3．其他（1）副結核分枝桿菌（2）麻風分枝桿菌（3）鼠麻風分枝桿菌

目前國際上多按培養時細菌生長速度分類，生長緩慢類中包含分枝桿菌復合群、非結核分枝桿菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組；生長快速類包括非結核分枝桿菌Ⅳ組；麻風分枝桿菌人工培養基上不能生長。

第二節結核分枝桿菌

一、分類結核分枝桿菌復合群中人結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌對人類致病，人型發病率最高，牛分枝桿菌對動物也發病。二、臨床意義

1865年國外學者用人型結核分枝桿菌感染家兔獲得成功，1878年在結核組織中發現結核桿菌，1882年Kock成功地進行了結核桿菌的培養并制造動物模型。從而確定了結核病的病原。

全世界有1/3人口19億人已感染結核分枝桿菌，15歲以下兒童感染者達1.8億，每秒種就有一人感染，全球有2000萬活動性患者，新發病1000萬人，每年有300萬人死于結核，死于結構的人數超過AIDS疾病、腹瀉及熱帶病死亡人數的總和，是傳染病死亡最多的。近年來AIDS的發病率上升，伴隨結核病上升。我國解放前結核嚴重流行，發病率大于1%，十癆九死之稱，建國后人民生活水平提高，衛生條件的改善，抗癆藥物的發現，特別是積極開展防癆工作，接種BCG，發病率和死亡率大大降低，但近年來有抗頭趨勢。（一）致病物質

結核分枝桿菌不產生內、外毒素及侵襲性酶類，致病性可能是細菌在組織內大量繁殖引起炎癥；菌體成分和代謝物質的毒性；菌體成分產生的免疫損傷。致病物質有：

1．莢膜主要成分是多糖，部分蛋白質和脂質，其作用①能與吞噬細胞表現的CR3結合，有助于細菌的粘附與入侵；②莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質，提供結核桿菌營養；③防止有害物質侵入。另外可抑制吞噬體與溶酶體的結合。2．脂質該菌的細壁所含的脂質占細胞壁干道的60%，成分復雜，與毒力關系密切。①索狀因子，為分枝菌酸和海藻糖結合的糖脂，成分為6-6雙分子菌酸海藻糖，使細菌生長呈索狀，具有破壞線粒體膜，影響細胞呼吸，抑制白細胞游走及引起慢性肉芽腫等作用；②磷脂，能刺激單核細胞增生，并能抑制蛋白對組織的分解作用，從而使病灶組織溶解不完全，形成結核及干酪樣壞死；③蠟質D，是分枝菌酸與肽糖脂的復合物，可引起遲發型超敏反應，具有佐劑作用；④硫酸腦苷脂，能抑制吞噬細胞中的吞噬體與溶酶體融合，使細菌能在吞噬細胞中存活。

3．蛋白質有抗原性，和蠟質D結合后發生超敏反應，引起組織損傷和全身中毒癥狀，并形成結核結節。

（二）所致疾病

人型結核桿菌主要通過呼吸道、消化道和損傷皮膚等多途經傳播，引起多臟器組織的結核病，以肺結核最多見，含結核桿菌的飛沫或塵埃經呼吸道侵入肺部后，90%可經纖毛運動而排出，一小部分進入肺泡，巨噬細胞吞噬，細菌在細胞內繁殖，大都在上肺下部，下肺上部形成滲出性炎癥的原發病灶，經淋巴管引流達到肺門淋巴結，典型者呈啞鈴狀，少數僅肺門淋巴結腫大。

原發感染多見于兒童及未感染過的成人，機體免疫力低下時，原發病灶惡化，經氣管淋巴道或血流播散，形成全身性粟粒性結核或結核性腦膜炎。當抗體抵抗力強時，使感染灶形成結核結節，淋巴結病灶纖維或鈣化，不治自愈。但病灶內常有一定量的細菌長期潛伏，不斷刺激抗體產生免疫，稱為帶菌免疫，也可成為以后內源性感染的來源。

繼發感染也稱免疫感染，2/3的活動性感染是由復活感染所致，多見于成人，好發于肺尖。也可由外源性感染，其特征為慢性肉菌腫，形成結核結節、干酪樣壞死和纖維化。部分患者，結核桿菌可經血流、淋巴擴散侵入肺外組織器官，引起相應的臟器結核如骨、腎、腦、關節及生殖器等。近來報道，肺外結核標本中結核分枝桿菌L型檢出率比較高，應引起足夠的認識。

（三）免疫性

人類感染率高，發病率低，說明人體有免疫力，一般為帶菌免疫或傳染免疫，當細菌或其成份完全消失后，機體的特異性免疫也隨之消失。特異性抗體沒有保護作用，若明顯升高，特別在3歲內可幫助診斷。

抗結核免疫是細胞免疫，致敏淋巴細胞與抗原相遇，釋放淋巴因子如INF-γ，作用于巨噬細胞，促使細胞內溶體含量增加，吞噬能力增強。在細胞免疫的同時產生遲發型超敏反應，如OT試驗，局部潰爛、壞死、附近淋巴結腫大。如果曾感染過結核，愈合較快。三、微生物特性1、形態與染色

一般呈桿狀，稍彎曲，牛型比人型較粗而短，有分枝生長趨勢。一般用萋-尼抗酸染色法，在痰標本中可見堆積成團、成束、排列不規則、呈鏈狀、索狀，可見異染顆粒。

（二）菌體成分結核分枝桿菌細胞壁含有脂質、多糖和蛋白質復合物。（三）變異易發生形態、菌落、最適生長溫度、毒力以及而耐藥性變異，BCG是歷時13年，傳230代，細菌毒力消失的牛型結核桿菌。化療后排出的細菌毒力減弱。

在體內外經藥物或溶菌酶影響肽聚糖的合成，形成細菌L型。異煙肼影響分枝桿菌的合成，可變為抗酸染色陰性。臨床結核性冷潰瘍和痰標中甚至還可見有非抗酸性革蘭陽性，過去稱為Much顆粒。該顆粒實際上是L型細菌。

2、培養特性

專性需氧菌，初次分離時加5%～10%CO2可促進生長。溫度35℃～37℃，pH6.4～

6.8。

營養要求高，在固體培養基上3周左右可見菌落，典型菌落為粗糙型，表面干燥呈顆粒狀，不透明，乳白色或淺黃色，如菜花樣，其培養基為改良羅氏培養基。

細菌生長慢，一般18hr繁殖一代，所以初次分離一般2～4周，菌落粗糙，邊緣不整齊，呈顆粒狀，若加入吐溫60或80可使其均勻生長，有毒株能在液體培養基中呈索狀生長。牛結核分枝桿菌·LJ菌落

（五）抵抗力較強，耐干燥，在干燥痰中存活半年以上，對化學消毒劑抵抗力強，但對乙醇敏感，由于基因突變的發生，對抗癆菌物易產生耐受性。

（六）生化反應不發酵糖類，能產生過氧化氫酶。人型結核分枝桿菌能合成煙酸，還原硝酸鹽，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，牛型則不能。人型和牛型的有毒株中性紅試驗陽性，無毒株則為陰性，亦失去索狀長生現象。

四、微生物檢驗

（一）檢驗程序涂片鏡檢，分離培養，藥敏試驗。（二）標本采集根據病變部位不同，采集相應的病變標本，肺結核清晨瀨口后去掉第一口痰，收取第二口痰。尿液收集清晨一次全部尿或24小時尿沉淀10~15ml送檢，必要時作無菌導尿送檢。腸結核取糞便，另外無菌抽取腦清液、胸水、腹水及關節液等。

（三）標本直接檢查

1．顯微鏡檢查（1）直接涂片染色鏡檢：挑取血絲痰、干酪樣邊上的痰，觀察100個視野，細菌呈紅色，背景呈藍色。經熒光染色的結核分枝桿菌，在黑色背景中呈黃色，涂片鏡檢結果應報告“找到或未找到結核分枝桿菌”。

（2）濃縮集菌涂片檢查法：如果直接涂片陰性，可離心取沉渣或痰液增厚可提高檢出率。

2．核酸檢測PCR法檢查但要注意假陽性。

3．抗PPDIgG陽檢測，可作為活動性結核分枝桿菌感染的快速診斷方法之一。

（四）分菌培養與鑒定

1．分離培養無菌標本如腦脊液、胸腹水等可直接或離心后取沉渣接種，有菌標本如痰和尿液要作適當處理。

（1）固體培養基培養法將處理后的標本接種于羅琴培養基或者青霉素血液瓊脂培養基，培養基中所含的孔雀綠或青霉素可抑制雜菌的生長。細菌生長緩慢、干燥、呈顆粒狀，灰白色菌落。涂片抗酸染色陽性，報告按表。（2）液體培養法無菌標本及處理的有菌標本于自動化血液培養系統。涂片與培養:涂片(+)培養(+)涂片(+)培養(-)涂片(-)培養(+)涂片(-)培養(-)

2．鑒定試驗涂片或培養檢測出抗酸桿菌，但不能確定，通過以下方法進行鑒定（1）PCR反向膜探針雜交ELISA法（2）DNA探針（3）16srRNA基因序列測定（4）高效液相色譜檢測分枝桿菌

（五）藥物敏感性實驗對于開放性肺結核，選擇敏感藥物非常重要，但個別體內、外結果不相符。

（六）免疫學診斷

1．結核菌素實驗（1）原理：結核菌素有兩種，一是舊結核菌素（OT），即結核分枝桿菌接種肉湯中培養4~8周，100℃加熱1小時，過濾，濾液在80度下濃縮至原體積的確良1/10，其中主要成分是OT；一是純蛋白衍生物（puriedproteinderivation,PPD），用三氯醋酸沉淀結核菌培養濾液后的純化物。局部皮內注射，與致敏淋巴細胞特異結合，在局部釋放淋巴因子，形成遲發型變態反應性炎癥。

（2）方法：取5uPPD或OT0.1ml皮內注射，2~3天后觀察結果，應特別注意有無硬結，不能單獨紅暈為標準。（3）結果分析：①陽性，有硬結，紅腫，直徑0.5~1.5cm之間，表明感染過結核，不能表示正在患結核；②強陽性，硬結直徑超過1.5cm，或者有潰爛，可能為活動期結核；③陰性，注射部位小紅點或稍有紅腫，無感染，但要分析下述情況，受試者感染早期；患其他傳染病或重癥結核；機體免疫功能低下。

（4）應用結核菌素試驗：有OT試驗或PPD

選擇BCG接種對象及測定接種效果；

結核菌素試驗對3歲以內兒童幫助診斷；

未接種BCG地區作流行病學調查；

借此可判斷腫瘤病人的預后，OT試驗陽性，說明病人有一定免疫功能，預后較好，否則預后較差。

2．全血干擾素測定法當全血與PPD和對照抗原（PHA）共同孵育后，致敏淋巴細胞可分泌IFN-，測IFN-可鑒定菌種。人分枝桿菌陽性判定標準為：

(IFN-人-IFN-空)(IFN-植-IFN空)0.15(IFN-人-IFN-空)-(IFN-鳥-IFN-空)(IFN-人-IFN-空)-0.10

本實驗所得結果與OT實驗相當，具有BCG影響小，又能與非結核分枝桿菌進行區分的優點，同時可避免菌素實驗在操作上與結果上存在的多種主觀或人為的因素的影響。

（七）動物接種用于結核桿菌分離和毒力測定，方法敏感可靠，但步驟繁瑣，不列入常規檢查。第三節非典型分枝桿菌（自學）第四節麻風分枝桿菌

1873年挪威學者ArmauerHansen從麻風患者皮膚節結中發現，又命名Hansen桿菌。

一、臨床意義麻風是一種慢性傳染病，主要表現為皮膚、粘膜和神經末梢的損傷。晚期可侵害深部組織和器官，形成肉芽腫。麻風病在全世界都有流行，世界衛生組織統計，1993全球有310萬麻風患者。我們國家由1957年40萬人到1997年病例4050人。新發現病例1958年3.5萬人，1997年1800人?，F在病例主要集中偏僻山區、草原牧區以及貧困地區。

最近有報告犰狳、猩猩等自然感染麻風，說明是人獸共患疾病，細菌隨病人鼻分泌物、痰、汗液、乳汁、精液或陰道分泌物排出，通過直接接觸或由飛末傳播。幾乎都是不顯性感染。只有少部分人發病。潛伏期長，一般6個月至5年，長達幾十年。發病慢、病程長，幼年時期最敏感。細菌沿末梢神經、淋巴、血行擴散至全身，特別是皮膚和眼。典型表現痛感覺障礙。根據臨床表現、免疫病理變化和細菌檢查結果等。可將麻風分為三種病型：瘤型麻風、結核樣型、界線類綜合征。

瘤型麻風為進行性和嚴重的臨床類型，占病例數