Diagram4核酸疫苗定義1235核酸疫苗的發展史核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的構建核酸疫苗的優缺點和應用現狀

疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。人們將多種滅活或減毒疫苗稱為第一代疫苗。將用基因工程的方法研制的亞單位疫苗稱為第二代疫苗。理想疫苗應具備的特征有：安全、廉價、熱穩定性好，含有多種具有保護作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前兩代均不能滿足上述標準。故基因疫苗應運而生。基因疫苗被稱為第三代疫苗。1990年wolff等從事于基因治療工作時，用外源性重組質粒給小鼠肌肉注射后，質粒被攝取并能在體內至少兩個月穩定地表達所編碼蛋白。1991年Williams等發現外源基因輸入體內的表達產物可誘導產生免疫應答。1992年Tang等將表達人生長激素的基因質粒DNA導入小鼠皮內，小鼠產生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。1993年Ulmer等將注射技術用于研究流感核酸疫苗，證實核酸注射不但能在體內表達抗原蛋白，還可以誘導具有顯著保護作用的免疫應答。因此，1994年在日內瓦召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。關于核酸免疫的國際會議1994年5月17-18日，瑞士日內瓦。WHO主辦。主題：核酸疫苗。1995年2月16-17日，美國馬里蘭州，Bethesda（NIH）。主題：基因疫苗和核酸疫苗戰略。1995年4月6-9日，美國弗吉尼亞州。主題：DNA疫苗：疫苗學的新時代。1996年2月5-8日，美國馬里蘭州NIHNatcher會議中心。主題：核酸疫苗預防傳染性疾病和控制核酸疫苗。

定義

核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也稱基因疫苗(geneticvaccine),是指一類將抗原基因重組到表達載體上的重組質粒疫苗，經肌肉注射或黏膜免疫等方法導入宿主體內，通過宿主細胞表達抗原蛋白，誘導宿主細胞產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。基因疫苗的構建基因疫苗構建的基本途徑基因疫苗的構建一、構建基因疫苗的載體載體是將抗原基因導入到機體細胞的必要工具。1.載體的分類按照載體功能可分為克隆載體和表達載體；按照載體來源可分為質粒、噬菌體、黏粒和病毒載體等。2.常用于構建基因疫苗的載體pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/RSV、pRc/CMV2等多種基因疫苗的構建二、基因疫苗的構建方法1.抗原基因和載體的制備獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構建基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)，從中調用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉錄合成互補的DNA片段，建立cDNA文庫；（3）利用聚合酶鏈式反應（PCR）特異性地擴增所需要的目的基因片段，等等。（4）化學合成基因疫苗的構建基因表達載體的組成：復制原點+啟動子+目的基因+終止子+標記基因

為了保證抗原基因的定向正確插入，只有以正確的方向插入表達載體讀框啟動子下游才能表達抗原基因，故抗原基因兩端應具有不同的酶切位點，在設計時須注意這點。2.抗原基因與載體的連接

連接的方式可分為粘性末端連接和平末端連接兩種，其中前者連接效率較高，使用比較多。連接反應時應考慮反應體積、抗原基因與載體的比例、溫度和時間和酶量。粘性末端連接用同一種或兩種限制性內切酶酶切DNA連接酶重組質粒質粒目的基因本法適用于在質粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點平末端連接

質粒產生平末端的內切酶DNA連接酶產生粘性末端的內切酶核酸酶S1目的基因重組質粒產生粘性末端的內切酶核酸酶S1本法適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點！基因疫苗的構建3.重組質粒轉化受體菌轉化：將質粒或者以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。轉染：將質粒或者以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程。感受態：細菌經過CaCl2溶液處理和短暫熱激后，容易攝入外源DNA，這種狀態稱為感受態。其原理是細菌處于0℃、低滲CaCl2溶液中時，細胞壁和細胞膜通透性增加。此時轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經短暫的熱激（42℃）處理后，外源基因容易進入細菌細胞內。常用的方法為氯化鈣共沉淀法和電穿孔法。基因疫苗的構建4.重組質粒的篩選與鑒定一般重組質粒鑒定主要按照表型篩選、酶切鑒定和測序鑒定的順序進行（1）插入片段鑒定：酶切鑒定；PCR鑒定。（2）插入片段方向性鑒定：可利用聯合酶切方案進行目的基因的插入方向鑒定。（3）DNA序列測定：末端終止法測序；自動測序儀測序基因疫苗的構建三、重組質粒在真核細胞中的表達與檢測1.重組質粒導入真核細胞的方法磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質體介導等方法都可以用來將外源質粒導入真核細胞，其中脂質體介導容易成功，是最常用的方法。2.抗原基因在真核細胞中表達的檢測（1）蛋白水平的檢測：免疫沉淀法檢測表達蛋白；Western印跡檢測；酶聯免疫吸附測定。（2）核酸水平的檢測：RNA印跡；RT-PCR檢測。

由于這個過程實際上是相當復雜的，所以人們對一些具體的細節并不清楚。下面通過對基因疫苗經過肌肉組織和黏膜免疫的抗原呈遞途徑來說明基因疫苗的工作原理。基因疫苗經黏膜和皮膚組織免疫的抗原呈遞

皮膚或者黏膜是具有高水平免疫監視系統的組織，黏膜淋巴組織的功能：參與粘膜局部免疫應答和產生分泌型IgA。而且在免疫動物時比較方便，尤其是大面積預防時，所以關于基因疫苗通過皮膚或黏膜免疫激活機體免疫反應機制的研究也比較活躍。

基因疫苗經過黏膜和皮膚組織免疫可以分為直接免疫機體和重組減毒胞內菌系統免疫兩種形式。（1）直接免疫旅美中國科學家范泓然用皮膚涂抹法給小鼠接種乙肝疫苗取得成功，且檢測其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。黏膜淋巴結提供了漿細胞抗體型轉化與Th0細胞向Th2細胞定向分化的微環境。基因疫苗經過黏膜免疫可以很好地激活B細胞分泌IgA，同時啟動Th2細胞功能，但其對細胞免疫（尤其是CTL細胞）活化不足，通過黏膜免疫獲得的保護作用不如通過肌肉免疫獲得的強烈。（2）用重組減毒胞內菌系統采用志賀氏菌、沙門氏菌或李斯特菌等重組減毒胞內菌系統，通過粘膜自然感染途徑運送DNA疫苗是一類很好的方法。因為它們可以將基因疫苗直接呈送給APCs，所以這種方法運送效率高、免疫方法簡單、免疫效果好，能同時激活粘膜免疫和全身免疫，并可獲得對載體菌的免疫等優點。減毒沙門氏菌通過自然感染的方式高效地將基因疫苗直接運送給體內的抗原提呈細胞（APCs）如樹突細胞（DCs）和巨噬細胞，在粘膜和全身淋巴組織誘發以Th1型應答為主的細胞免疫和體液免疫，APCs尤其是DCs可能在其中起到了關鍵作用。攜帶基因疫苗重組減毒沙門氏菌誘發機體免疫應答的機制

重組減毒沙門氏菌攜帶的基因疫苗激發機體的細胞免疫和體液免疫的機制還不完全清楚。可能途徑一：DCs和巨噬細胞吞噬侵入腸粘膜屏障的重組沙門氏菌并被激活，活化的DCs和巨噬細胞遷移到脾臟等淋巴組織（DCs具有很強的遷移能力，而巨噬細胞尚有一些疑問），載體菌在此裂解，基因疫苗進入胞液，然后進入細胞核，最后表達目的抗原。接著激活特異的CTL，裂解表達抗原的APCs，APCs內的抗原被釋放激活輔助T細胞和誘導抗體反應，激活細胞免疫和體液免疫。可能途徑二：重組沙門氏菌引起吞噬它的APCs凋亡，凋亡產物（含有目的抗原/基因疫苗）被鄰近的APCs吞噬。核酸疫苗的優缺點優點：1免疫保護力增強

2制備簡單，省時省力

3同種異株交叉保護

4應用較安全

5產生持久免疫應答

6貯存、運輸方便

7可用于防治腫瘤缺點：1質粒DNA可能誘導自身免疫反應

2持續表達外源抗原可能產生一些不良后果

3肌肉注射質粒后，僅有很少部分被肌細胞所攝取

4影響核酸疫苗誘發機體免疫應答的因素很多５外源DNA注入體內后，可能整合到宿主基因組上，使宿主細胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主細胞轉化成癌細胞核酸疫苗的應用現狀有關質粒DNA疫苗在人類及動物產生預防和治療作用的研究報道不斷增加，應用范圍也逐漸擴大。人們期望用核酸疫苗來征服諸如微生物感染性疾病、寄生蟲病等頑癥，并用于腫瘤、遺傳病和其他多種疾病的基因水平治療，所以作了多方面的嘗試。病毒感染性疾病的核酸疫苗非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗寄生蟲核酸疫苗腫瘤核酸疫苗發展前景

核酸疫苗的研究只是近十幾年發展起來的一項新的生物技術，它已成為疫苗研究領域中的熱點之一，特別是其研究方向與世界衛生組織兒童疫苗計劃的長遠目標（用一種疫苗預防多種疾病）相吻合。現在已獲得了迅速的發展。它的研究具有深遠意義，可用于細菌、病毒、寄生蟲等多種疾病的防治，其多價、高效、廉價等優點使其潛在的應用價值不可估量。核酸疫苗可能對人類疾病的防治以及畜牧業的健康發展起到劃時代的作用。

核酸疫苗研究

進展

一、概述

核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒基因直接免疫機體，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應。（一）概念（二）DNA疫苗的構成：

1.抗原表達基因

2.真核細胞啟動子（如CMVI.E啟動子）

3.PolyA終止序列（如來自SV40或BGH基因）

4.原核細胞選擇標志（如青霉素抗性基因）

5.增強免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷)

二、DNA疫苗載體1.裸DNA疫苗：質粒、MIDGE載體2.病毒載體：天花病毒、腺病毒3.細菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗4.微粒包裹載體：金顆粒(goldparticle)、脂質體(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）、藻酸鹽微粒(alginate)、和納米微粒(nanoparticles)Variousmethodsofgenedelivery

三、DNA疫苗與常規疫苗的比較DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位抗原類型內源性內源性外源性APC加工過程蛋白酶體蛋白酶體溶酶體體液免疫應答B細胞＋＋＋＋＋＋＋＋＋主要的IgG類別IgG2aIgG2aIgG1DNA疫苗與常規疫苗比較DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位細胞免疫應答CD4＋＋＋＋Th＋/－Th1＋/－Th1CD8＋＋＋＋＋＋－抗原提呈Ⅰ/ⅡⅠ/ⅡⅡ免疫記憶體液免疫＋＋＋＋＋＋＋＋＋細胞免疫＋＋＋＋＋＋/－參與細胞因子IL-2,4，IFN-γ,TNF-βIL-2,IFN-γ,TNF-βIL-4，5，10,13DNA疫苗與常規疫苗比較(續1）DNA疫苗減毒活疫苗滅活疫苗/蛋白亞單位效應機制CTLCTL中和反應激活補體ADCC效應制備易于構建、生產＋＋＋＋

＋＋＋費用＋＋＋

＋＋運輸/存儲＋＋＋

＋＋＋＋安全性＋＋＋＋＋＋＋＋＋DNA疫苗與常規疫苗比較(續2）核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優勢：(1)誘導機體產生全面的免疫應答，其保護性免疫應答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用；(2)無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用，具有可靠的安全性；(3)能表達經修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構象和抗原性；(4)與亞單位疫苗共有的高產性；(5)可將編碼不同抗原的基因構建在同一個質粒中，或將不同抗原基因的多種重組質粒聯合應用，制備多價核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有預防作用，也有治療作用；(7)生產簡便，成本低廉，穩定性好，貯運方便。 四、核酸疫苗誘導的免疫反應核酸疫苗誘導的全身免疫應答反應

關于核酸疫苗誘導全身免疫應答反應的機制目前了解的還不十分清楚，但其誘導過程可大致分為以下幾個階段：①疫苗的攝取、轉運及表達；②抗原的加工和提呈；③淋巴細胞的活化；④免疫效應細胞和分子的作用。

ImmunemechanismsinducedbyinoculationwithnakedDNADepictionofthemechanismsofgenerationofantigen-specifichumouralandcellularresponses.五、核酸疫苗的構建

1、將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因。2、多肽合成疫苗的核酸推導序列作用核酸疫苗的候選基因3、從病原體亞單位成分中篩選保護性抗原及編碼基因

3．1免疫篩選法3．2化學分解法

候選基因的篩選原則LigatePCRproductintopTARGETTMVectorTransformTG1cellsSelecterecombinantclonesbyampicillinpstⅠ酶切鑒定挑取S基因正向插入的重組質粒pTARGET-hanS測序重組質粒pTARGET-hanS的構建:引物1:CTACTATGGCAACTATGGAGGAA引物2:ACTAATTAGAGTTTCAAAGGCTCPCR正向:酶切成3674，1870，1470反向:可酶切成3674，2600,740可酶切成5.6kb和1.3kb左右兩個片段EcoRⅠ酶切瓊脂糖凝膠電泳回收5.6kb左右的大片段對照空載體pTARGET的構建：用連接酶連接成為閉環pTARGET空載體,作為對照載體備用。培養Vero-E6細胞MEM培養基(10%FCS)37℃，5%CO2細胞長至對數生長期電穿孔轉染重組質粒轉染后72h，收獲細胞檢測核蛋白的瞬時表達,熒光顯微鏡下觀察并拍照。間接免疫熒光法重組質粒pTARGET-hanS體外瞬間表達:核蛋白的瞬時表達結果作為DNA免疫的注射樣品。質粒的大量制備及純化:按分子克隆手冊所述方法提純質粒pcDNA3.1+和pcDNA3.1+S用滅菌的PBS溶解調整濃度至1.0mg/ml用分光光度計測定A260/A280比值以確定核酸樣品的純度，A260確定樣品的濃度實驗動物的DNA免疫6～8W齡的BABC/c小鼠空白質粒pcDNA3.1+重組質粒pcDNA3.1+S免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預處理3天后相同部位進行DNA接種加強免疫一次，共免疫3次。間隔2周細胞因子的動態變化常規方法分離脾細胞，濃度1×10724孔細胞培養板每孔加入脾細胞懸液0.5ml，NP10l(同時設空白對照孔，ConA刺激孔)均設3個復孔37℃、5%CO2孵箱培養48小時后收集脾細胞上清液，貯于-70℃，統一用ELISAkits檢測IL-4和IFN-分別于免疫后5d,10d,17d,35d,42d每組處死3只小鼠淋巴細胞增殖反應:脾細胞取自初次免疫后42d的免疫鼠以重組的核蛋白刺激免疫小鼠的脾細胞陰性對照孔和陽性對照孔(ConA)用MTT法檢測脾細胞的增殖反應，計算刺激指數（SI）常規方法分離脾細胞,濃度調整至2×106免疫鼠血清的抗NP抗體的測定:免疫前和免疫后5d,10d,17d,35d,42d經尾靜脈采血N=6/group以被檢標本復孔（3孔）OD值與免疫前血清（陰性對照）的比值≥2.1者為陽性。重組的NP作為包被物，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗ELISA法檢測血清的抗NP抗體血清抗NP抗體滴度的測定:將初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血N=6/group留置血清，以10倍稀釋為起點,再做系列稀釋ELISA法檢測血清抗體滴度六、核酸疫苗的優化1、免疫效果的優化選擇高效表達載體添加DNA免疫激活序列2、免疫途徑的優化

肌肉注射（im）基因槍導入皮內(id)和皮下(sc)注射黏膜表面接種EffectsofCpGmotifsonvariouscellsGenerationofImmunityafterInoculationofDNAPlasmidwithGpGMotifs2、免疫途徑的優化

3、基因佐劑的應用細胞因子類共刺激分子分子佐劑聯合

4、抗原蛋白的泛素化表達IL-12、IL-15、IL-18及IFN-γ以增強Th1型細胞應答為主。

IL-4加強體液免疫IL-2能同時加強體液免疫和細胞免疫

集落刺激因子5、與基因重組疫苗聯合應用

細胞因子產生的動態變化細胞因子產生的動態變化免疫鼠脾細胞的增殖反應血清特異性抗體的檢測結果血清特異性抗體的檢測結果免疫鼠脾細胞的增殖反應免疫鼠脾細胞的增殖反應血清的抗NP抗體的測定結果血清的抗NP抗體的測定結果七、核酸疫苗的安全性問題

①局部反應原性和全身毒性研究，即考慮DNA疫苗是否有免疫毒性作用，機體是否對疫苗編碼的抗原產生耐受性，或是否導致自身免疫反應，還應對疫苗中污染的細菌蛋白是否誘發抗體產生進行評估；②遺傳性作用，即質粒DNA是否與宿主基因組的整合問題；③生殖毒性研究，可采用PCR方法對經質粒DNA疫苗免疫的雄性或雌性動物的性腺DNA提取物進行檢測④致腫瘤性研究，如果質粒DNA疫苗構建具有與人的基因組同源的DNA序列，或其載體含有已知的潛在致癌基因序列時，需展開這方面的研究。1、有關基因整合的研究

一個最重要的理論危機是質粒DNA與宿主基因組整合的問題，因為當外源DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩定，從而導致腫瘤細胞形成。

尚無證據證明以自身表達質粒的形式存在于染色體外的外源DNA能整合入宿主染色體中。其整合發生率較自然整合發生率低3個數量級，另鮭魚精DNA已經以一種非處方藥形式經口服或注射等多種方式使用了數十年，卻未見任何明顯的副作用。

一些事實已清楚地證明脾內或口服裸DNA可能導致整合2、關于免疫耐受的研究外源性抗原的持續表達可能產生不良后果：耐受性、自動免疫、過敏反應、超免反應等。持續低表達---可被抗體中和清除，無足夠的免疫應答。持續高表達---超免反應發生—免疫抑制

—其它病原感染。

免疫2天的小鼠產生耐受免疫出生24小時內的小鼠，與在成年小鼠中觀察到的沒有區別。

HBsAg轉基因小鼠進行DNA免疫，使已經建立的對HBsAg的特異性免疫耐受狀態被打破，使小鼠產生抗HBsAg的特異性抗體。實驗結果：結論：免疫耐受與抗原類型、濃度、給藥方式及宿主種屬、宿主年齡等因素有關。3、關于自身免疫性疾病的研究

潛在性誘導抗質粒DNA的免疫反應是另一個必須關注的安全性問題。研究表明：用細菌DNA與mBAS及CFA形成的復合體免疫小鼠，能誘導小鼠產生與哺乳動物dsDNA發生反應的IgG自身抗體。用各種構建的質粒載體進行的質粒DNA的免疫并未發現抗DNA抗體的產生。

DNA疫苗接種有自身免疫傾向的小鼠，重復給藥并沒有啟動或加重具有狼瘡傾向個體的疾病發生及發展過程。

4、其它不良反應進行的Ⅰ期臨床試驗表明，未觀察到不可接受的不良反應。

八、DNA疫苗的應用

（一）感染性疾病（二）腫瘤（三）自身免疫病與變態反應表病毒的DNA疫苗病毒抗原免疫途徑動物模型流感病毒HIV-1，2SIVFIVHTLV-1HBVHCVHEV狂犬病毒NP，HAenv混合，env，gag混合，envenv，rexHBsAg，envC，E2ORF3GP肌注，基因槍，皮下，靜注，in.肌注，基因槍，靜注，鼻內，陰道內肌注，基因槍，靜注肌注肌注肌注，皮下肌注肌注，基因槍，皮下小鼠、雞、豬、雪貂小鼠、恒河猴、猿猴、人恒河猴大鼠兔小鼠、猿猴小鼠小鼠小鼠、猴病毒抗原免疫途徑動物模型偽狂犬病毒登革熱病毒麻疹病毒腦心肌炎LCMV輪狀病毒猿猴病毒40牛皰疹病毒柯薩奇病毒埃博拉病毒HSV-1，2細小病毒CRPVRSVIE180,gD,gCpreM＋envHA,NPVP1NPVP6,VP4,VP7T-AggDVP1，混合NP,GPgB,ICP27，gD2VP1L1F肌注，基因槍基因槍肌注肌注肌注，皮下，基因槍，口服肌注肌注，皮下肌注基因槍肌注，眼內肌注肌注肌注，皮內小鼠，豬小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠牛小鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠狗兔小鼠表病毒的DNA疫苗（續）表細菌的DNA疫苗細菌抗原接種途徑動物模型結核分枝桿菌伯氏疏螺旋體破傷風桿菌肺炎支原體沙眼衣原體傷寒沙門菌Hsp65，Ag85A,B,C19kDa.AhpCOspA破傷風毒素ELIMOMP，CTPOmpC肌注肌注,皮下肌注肌注小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠表