感染性疾病分子診斷感染性疾病分子診斷1（優選）感染性疾病分子診斷（優選）感染性疾病分子診斷2第十章感染性疾病的分子診斷分子診斷（moleculardiagnosis）是指通過檢測基因的結構異常或其表達異常，對人體的健康狀態和疾病作出診斷的方法。評估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料，而評估基因的表達量則以基因轉錄或翻譯的產物RNA/蛋白質分析來評估個體的生理/病理狀態。第十章感染性疾病的分子診斷3分子診斷技術主要包括核酸雜交聚合酶鏈式反應（PCR）基因芯片技術分子診斷技術主要包括4

感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統稱。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。

內源性感染：指由人體自身的正常菌群，在人體免疫功能下降時引起的感染，因為這些細菌必須在一定條件下才能致病，所以又稱為條件致病菌或機會致病菌，如腸道菌群中的大腸埃希菌、腸球菌等引起的感染多為內源性感染。

感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統稱。5分子診斷對感染性疾病可用于以下幾個方面：

適用不易培養的；種屬鑒定；早期診斷；動態監測；流行病學調查；基因分型；耐藥檢測。分子診斷對感染性疾病可用于以下幾個方面：6感染性病原體進行分子診斷，取決于兩個條件：一是在該病原體核酸中有特異的核酸序列（感染性病原體本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型這些保守序列的變異也很小，因此可以根據保守序列設計探針或引物）；二是能夠根據特異的核酸序列設計和制備具有特定信號的探針或設計合成相應PCR引物，多數感染性疾病的病原體都具備上述兩個條件。感染性病原體進行分子診斷，取決于兩個條件：7近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpC基因。還可通過對HCVRNA拷貝數的監測，評價干擾素和其他抗病毒藥物的療效。固相雜交法探針雜交法是檢測耐藥基因突變的另一種快速簡便篩選方法。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。種屬鑒定；定量檢測可判斷HCV的傳染性及病毒復制情況，進行病情評估、判斷病人預后。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。用于抗生素治療的療效觀察及監控。拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進程，終止肝硬化的發展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區突變的影響。疾病種類多樣化適用不易培養的；gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內。直接測序法耐藥區域PCR擴增，PRC擴增產物純化或克隆化取DNA片段直接測序，與標準敏感菌株的同一DNA片段比較，分析堿基突變的位置和分布。核酸檢測技術主要用于被高度懷疑有原發感染,且經抗體檢測之后抗體檢測陰性或不確定時;有高危行為或暴露史,特別是伴有相應臨床表現時,早期診斷主要用于個體檢測、血液篩查、HIV陽性產婦的嬰兒診斷。結核分枝桿菌1882年由RobertKoch發現，對人致病的主要是人型結核分枝桿菌，引起結核病。結核桿菌對FQ的耐藥與gyrA和gyrB基因突變有關。對艾滋病病毒的消毒可以根據消毒物品選擇適當的物理方法或化學方法。診斷策略可以分為以下兩種：一般性檢出策略完整檢出策略近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術8一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型別（包括變異株）和耐藥性方面的信息，因此，對于感染感染性疾病分子診斷一般性策略只是快速診斷是何種病原體的感染。一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型9

為了得到更多的疾病病原體信息，建議應該采取完整策略按照診斷→分型→亞型→耐藥性檢測的思路，利用多種分子診斷手段對感染性病原體進行分析。為了得到更多的疾病病原體信息，建議應該采取完整策略按10第一節病毒的基因檢測

人類許多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、腦炎、脊髓灰質炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根據病毒的核酸成分，可將其分為脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類。第一節病毒的基因檢測11一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，屬嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含內源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有獨特的復制方式，病毒合成以RNA中間體為模板，經反轉錄合成DNA鏈，在某些方面，HBV與逆轉錄病毒有許多相似性。

一、乙型肝炎病毒12

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,

據估計全球大約有20億人曾經感染乙肝病毒,慢性HBV感染者約315億~4億人,每年有50萬~120萬人死于HBV感染。我國是乙型肝炎的高發區,每年約有10%~20%的急性乙肝將轉成慢性肝炎,肝硬化甚至發展成肝癌,嚴重威脅著人們的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌變的發生機制是多年來肝病研究的重點。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,13HBV感染的病原學診斷免疫血清學檢測HBV的血清學標志物分子生物學方法檢測免疫學方法測定病毒抗體是一種快速簡便的檢測手段,常用的方法是間接ELISA,目前我國HBV檢測采用的第三代ELISA試劑由多種病毒抗原組合匹配,具有較好的靈敏性和特異性,但其在病毒感染的窗口期不能檢測到抗體,這在很大程度上限制了ELISA檢測的準確性,不能有效的控制病毒的傳播,因而,發展新的診斷HBV感染主要依賴分子生物學技術對病毒DNA的檢測。HBV感染的病原學診斷14感染性疾病分子診斷課件15（一）病毒基因組結構HBV是一種可感染人體、且具有獨立復制能力的雙鏈DNA病毒，具有以下幾個特點：①不完全雙鏈環狀結構；②利用重疊的開放讀碼框架(ORF)可編碼多個蛋白質；③所有調控序列均位于蛋白質編碼區；④基因序列具有多變性。HBV基因組是已知可感染人類又能獨立進行復制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的。

（一）病毒基因組結構16HBV基因組具有獨特的結構，是一個長約3.2kb的不完全雙鏈環狀DNA。雙鏈的長度不對稱，長鏈(L)因與病毒mRNA互補，定為負鏈；短鏈(S)為正鏈，5’末端固定，3’末端位置不固定，S正鏈的長度可為L負鏈的50~100%，因而在病毒群體中出現不同長度的正鏈與全長的負鏈匹配，故僅有部分基因組長度為雙鏈。HBV基因組L鏈上至少有4個ORF，分別稱為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。多個ORF重疊的結果使HBV本身3.2kb基因組序列的利用率高達150~200%。HBV基因組具有獨特的結構，是一個長約3.2kb的不完全雙17感染性疾病分子診斷課件18（二）分子診斷方法1．PCR

2.支鏈DNA技術3.核酸雜交4.基因芯片技術（二）分子診斷方法19逆向斑點雜交法原理就是將各種探針固定在基質上,用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。逆向斑點雜交法20FeO/Au納米顆粒探針法近年來,通過納米表面結合寡核苷酸構成納米顆粒基因探針,用于檢測靶脫氧核糖核酸。其原理是利用DNA堿基嚴格互補配對的特性設計的,主要應用于分子的組裝。FeO/Au納米顆粒探針法21衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉錄的引物)。判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。第十章感染性疾病的分子診斷對艾滋病病毒的消毒可以根據消毒物品選擇適當的物理方法或化學方法。Vif基因對HIV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產生和體內傳播。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應用等，結核病發病率逐年上升，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。當停止應用拉米夫定治療后，野生株通常會替代變異株。這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpC基因。該方法可快速鑒定結核桿菌RFP耐藥株ropB基因的突變，適合于臨床標本的直接檢測。5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。可采用PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR等方法檢測標本中的TBDNA。現已有商品化LiPA試劑盒，該試劑盒檢測配藥物敏感試驗結果的符合率為90.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內繁殖周期中起一定作用。種屬鑒定；細菌學涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結核，但是陽性率很低，而且不能區別結核桿菌和不典型結核桿菌。近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)屬黃病毒科。一般認為PZA是通過在菌體內被吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸而發揮作用。HBVDNA拷貝數越高，病毒復制越厲害，傳染性越強，肝臟病理損害程度越高，肝組織炎癥反應越重。應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,

聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法該法利用錯配PCR的原理擴增HBV前C區長194bp,C啟動子區長184bp的基因片段,擴增產物分別經限制性內切酶Bsu361,Bc1I酶切,瓊脂糖凝膠電泳,根據酶切圖譜多態性,建立檢測HBV前CA1896,BCPT1762/A1764雙變異的方法,衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)22乙型肝炎病毒DNA等溫擴增技術HBV的病毒載量與感染狀態密切相關,尋求快速、簡便、靈敏、特異的定量手段是對HBV早期診斷、病程監控及流行病學調查的需求。乙型肝炎病毒DNA等溫擴增技術23（三）臨床意義1．HBV感染的早期診斷

2.監測治療效果

3.判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。HBVDNA拷貝數越高，病毒復制越厲害，傳染性越強，肝臟病理損害程度越高，肝組織炎癥反應越重。4.在乙型肝炎病毒耐藥檢測中的應用（三）臨床意義24HBVDNA檢測是乙肝病毒抗病毒治療的有效監測指標。乙肝病毒藥物治療后,HBVDNA含量持續下降,然后持續在低水平,或低至方法學能檢出的含量(測定下限)以下,則說明治療有效。觀測抗病毒藥物治療效果不能憑兩三次檢測結果來判斷,必須多次動態觀察,每次檢測的間隔天數不宜太短,一般為兩周以上。可采用以檢測次數為橫坐標,HBVDNA量為縱坐標作圖的方法來判斷血清HBVDNA量的變化趨勢,進而判斷抗病毒治療是否有效。血循環中HBVDNA濃度與HBsAg和HBeAg有一定的相關,但其濃度間并不呈正線性相關。HBVDNA檢測是乙肝病毒抗病毒治療的有效監測指標。乙肝25拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進程，終止肝硬化的發展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區突變的影響。該藥與干擾素合用有協同作用。拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV26長期服用拉米夫定會引起HBV基因突變而造成耐藥，其中95%是由于HBV基因組P區中高度保守的YMDD功能區（Y酪氨酸—M甲硫氨酸—D天冬氨酸--D天冬氨酸）發生突變：第552位甲硫氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）代替，突變后的HBV稱為YVDD變異株和YIDD變異株。由于變異造成基因組核苷酸與DNA多聚酶的結合能力有降低，通常變異株的復制能力低于野生株。當停止應用拉米夫定治療后，野生株通常會替代變異株。長期服用拉米夫定會引起HBV基因突變而造成耐藥，其中95%是27HBeAg陽性的標本,HBVDNA通常有較高的濃度,HBeAg陰性、抗HBe陽性的標本,HBVDNA濃度通常較低。當HBV基因組前C區發生突變時,則可出現HBeAg陰性而HBVDNA仍保持在較高的濃度。單獨抗HBc陽性的血液HBVDNA濃度通常很低。HBeAg陽性的標本,HBVDNA通常有較高的濃度,28致病：致病物質近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。短鏈(S)為正鏈，5’末端固定，3’末端位置不固定，S正鏈的長度可為L負鏈的50~100%，因而在病毒群體中出現不同長度的正鏈與全長的負鏈匹配，故僅有部分基因組長度為雙鏈。適用不易培養的；env基因表達產物激發機體產生的抗體無交叉反應。提高臨床標本檢測的陽性率和準確性。分析結核桿菌和牛分枝桿菌PZA耐藥株，發現該酶活性顯著降低，提示酶活性喪失與耐藥密切相關。SM耐藥性與編碼核糖體的二部分基因突變有關，它們是編碼16SrRNA的rrs基因和編碼S12蛋白的rpsL基因。觀測抗病毒藥物治療效果不能憑兩三次檢測結果來判斷,必須多次動態觀察,每次檢測的間隔天數不宜太短,一般為兩周以上。疾病種類多樣化吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)PZA作用機制和耐藥分子機理尚不清楚。人類免疫缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一株HIV以來，現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3種。根據病毒的核酸成分，可將其分為脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類。在感染后會整合入宿主細胞的基因組中，而目前的抗病毒治療并不能將病毒根除。另外幾個關鍵因素是:雖然新的培養法BACTEC法顯著縮短了培養、菌型鑒定結果的報告時間，但由于該法使用放射性底物而使它的應用受到了限制。病毒含量低的血液，經過自然干涸2小時后，活力才喪失;而病毒含量高的血液，即使干涸2-4小時，一旦放入培養液中，遇到淋巴細胞，仍然可以進入其中，繼續復制。鏈霉素(srreptomycin，SM)鏈霉素是抗結核治療中常用氨基糖甙類抗生素。結核桿菌對FQ的耐藥與gyrA和gyrB基因突變有關。1．HBV感染的早期診斷

關于血液中HBVDNA濃度與患者傳染性之間的關系,如血清中HBVDNA濃度大于109拷貝/ml,則在日常生活密切接觸中即具有較強的傳染性。105~106拷貝/ml,則在日常生活密切接觸中的傳染性較小。小于105拷貝/ml,則日常生活密切接觸中幾乎沒有傳染危險性。但不管HBVDNA的濃度為多少,哪怕是低于相應PCR方法的下限,也均會引起輸血后的感染。致病：致病物質關于血液中HBVDNA濃度29

基因分型方法,

一種在臨床上準確、快速、簡便地對乙型肝炎病毒進行基本分型(BCD)的方法,該方法通過大量分析已分型的HBV基因組序列,尋找出HBV各基因型的型特異性鹼基的分布規律,設計型特異性的引物和探針,利用已知全序列HBV建立熒光PCR是目前最靈敏的檢測方法之一,檢測極限可達到100copise/ml的DNA濃度。基因分型方法,30二、丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)屬黃病毒科。目前發現約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無輸血史的散發型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部分HCV感染者不出現臨床癥狀，但有50%會發展成為慢性，且易致肝硬化和肝癌。HCV主要通過輸血感染(是輸血后肝炎的主要致病因子)，也可由靜脈注射或母嬰和家庭內接觸而獲得。二、丙型肝炎病毒31（一）病毒基因組結構 丙型肝炎病毒呈球形顆粒，直徑約50nm，有一脂質包膜。核心含單股正鏈RNA，長9.4kb。整個基因組只有一個可讀框，位于基因組中央，編碼一條含有（一）病毒基因組結構32RNA病毒中的RNA能自我復制，大部分RNA病毒是單鏈的，復制一般是先以自己為模板合成一條互補的單鏈，病毒原有的、起模板作用的鏈稱為正鏈，新復制的RNA鏈稱為負鏈。RNA病毒中的RNA能自我復制，大部分RNA病毒是單鏈的，復33感染性疾病分子診斷課件34病毒含量低的血液，經過自然干涸2小時后，活力才喪失;而病毒含量高的血液，即使干涸2-4小時，一旦放入培養液中，遇到淋巴細胞，仍然可以進入其中，繼續復制。HBV感染的病原學診斷科赫（RobertKoch）宣布發現結核桿菌-----世界防治結核病日其原理是利用DNA堿基嚴格互補配對的特性設計的,主要應用于分子的組裝。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應用等，結核病發病率逐年上升，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。1．HBV感染的早期診斷Rev基因產物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應的病毒結構蛋白。由于變異造成基因組核苷酸與DNA多聚酶的結合能力有降低，通常變異株的復制能力低于野生株。正常菌群與人體之間的平衡受某些條件的破壞可導致疾病，此時這些細菌為條件致病菌。淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae,NG)，是淋病的病原菌。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae,NG)，是淋病的病原菌。105~106拷貝/ml,則在日常生活密切接觸中的傳染性較小。13%rpoB基因突變的RFP高度耐藥株仍對利福布丁(rifabutin)敏感，提示可采用利福布丁治療某些RFP耐藥的結核病。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。人類免疫缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一株HIV以來，現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3種。在HCV的感染中，第一周內就可以檢測出HCVRNA，拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進程，終止肝硬化的發展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區突變的影響。人類免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形。（二）分子診斷方法1．PCR2.核酸雜交3.bDNA技術4.基因芯片技術病毒含量低的血液，經過自然干涸2小時后，活力才喪失;而病毒含351.定性檢測雖然抗HCV并不是保護性抗體，臨床上可以根據抗HCV來判斷是否感染，但由于患者免疫功能的差異，僅有部分患者出現抗HCV，且抗HCV尚會出現時陰時陽的表現。采用分子生物學技術檢測到HCVRNA的存在是HCV感染的確證標志。檢測HCV-RNA可對丙型肝炎作早期診斷，解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。在HCV的感染中，第一周內就可以檢測出HCVRNA，1.定性檢測雖然抗HCV并不是保護性抗體，臨床上可以根362.定量檢測可判斷HCV的傳染性及病毒復制情況，進行病情評估、判斷病人預后。還可通過對HCVRNA拷貝數的監測，評價干擾素和其他抗病毒藥物的療效。另外，人們注意到臨床分型與療效的關系，發現如III型HCV患者對干擾素的療效更佳，此時也需要采用分子生物學技術對HCV進行病毒分型。2.定量檢測可判斷HCV的傳染性及病毒復制情況，進行病37三、人類免疫缺陷病毒人類免疫缺陷病毒HIV)，顧名思義它會造成人類免疫系統的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首次發現。它是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒，屬反轉錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導致免疫系統的失去抵抗力，而導致各種疾病及癌癥得以在人體內生存，發展到最后，導致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)。三、人類免疫缺陷病毒38人類免疫缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一株HIV以來，現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3種。人類免疫缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一39

在感染后會整合入宿主細胞的基因組中，而目前的抗病毒治療并不能將病毒根除。

病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。在感染后會整合入宿主細胞的基因組中，而目前的抗病毒治療40體外生存人類免疫缺陷病毒在人體外生存能力極差，不耐高溫，抵抗力較低，離開人體不易生存，常溫下只可生存數小時至數天。HIV對熱敏感。在56℃條件下30分鐘即失去活性，但在室溫保存7天，仍保持活性。滅活方法體外生存41不加穩定劑病毒在-70℃冰凍下失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清在-70℃時冰凍3個月仍保持活性。對消毒劑和去污劑亦敏感，0.2%次氯酸鈉、0.1%漂白粉、70%乙醇、35%異丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%來蘇爾處理5分鐘能滅活病毒，1%NP-40和0.5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。對紫外線、γ射線有較強抵抗力。不加穩定劑病毒在-70℃冰凍下失去活性，而35%山梨醇或5042國際衛生組織推薦對艾滋病病毒滅活加熱100℃持續20分鐘，效果較理想。艾滋病病毒的消毒主要是針對被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、體液污染的醫療用品、生活場所等。例如，輔料、紗布、衣物等。對艾滋病病毒的消毒可以根據消毒物品選擇適當的物理方法或化學方法。需要重復使用的物品可用煮沸或高壓蒸汽消毒。不宜煮沸的物品可用2%戊二醛、75%酒精等進行消毒。國際衛生組織推薦對艾滋病病毒滅活加熱100℃持續20分鐘，效43體液生存在室溫下，液體環境中的HIV可以存活15天，被HIV污染的物品至少在3天內有傳染性。近年來，一些研究機構證明，離體血液中HIV病毒的存活時間決定于離體血液中病毒的含量，病毒含量高的血液，在未干的情況下，即使在室溫中放置96小時，仍然具有活力。即使是針尖大小一滴血，如果遇到新鮮的淋巴細胞，艾滋病毒仍可在其中不斷復制，仍可以傳播。體液生存44結核桿菌的分子耐藥機理

異煙肼(INH)異煙肼通過抑制結核桿菌分枝菌酸的合成，造成細胞壁破損而殺菌。Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內繁殖周期中起一定作用。每個RNA的長度約為9.近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。另一些細菌因其本身所具有的毒性及侵襲力，一旦進入人體將會造成人體的感染，統稱為病原菌。一般認為PZA是通過在菌體內被吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸而發揮作用。整個基因組只有一個可讀框，位于基因組中央，編碼一條含有1、IS6110插入序列：僅見于MTBC.該藥與干擾素合用有協同作用。結核病2006年全世界流行分布情況1882年3月24日，羅伯特.采用分子生物學技術檢測到HCVRNA的存在是HCV感染的確證標志。Rev基因產物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應的病毒結構蛋白。它是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒，屬反轉錄病毒的一種。該藥與干擾素合用有協同作用。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。氟喹諾酮類(fluoroquinolones，FQ)MDRTB的暴發流行使FQ成為最主要的二線抗結核藥物。病毒含量低的血液，經過自然干涸2小時后，活力才喪失;而病毒含量高的血液，即使干涸2-4小時，一旦放入培養液中，遇到淋巴細胞，仍然可以進入其中，繼續復制。所以，含有HIV的離體血液可以造成感染。盡管艾滋病毒見縫就鉆，這些病毒也有弱點，它們只能在血液和體液中活的細胞中生存，不能在空氣中、水中和食物中存活，離開了這些血液和體液，這些病毒會很快死亡。結核桿菌的分子耐藥機理

異煙肼(INH)異煙肼通過抑制結核45形態結構人類免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類脂包膜，來自宿主細胞，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41;gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過非共價作用結合。向內是由蛋白p17形成的球形基質，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼，衣殼在電鏡下呈高電子密度。衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉錄的引物)。形態結構46感染性疾病分子診斷課件47（一）病毒基因組結構

HIV屬逆轉錄病毒科，該科病毒帶有以RNA為模板合成DNA的逆轉錄酶。HIV顆粒的核心有兩個拷貝的單股正鏈RNA，兩個單體通過5’末端的氫鏈結合形成二聚體。每個RNA的長度約為9.7kb。

（一）病毒基因組結構48兩端是長末端重復序列(longterminalrepeats,LTR)，含順式調控序列，控制前病毒的表達。已證明在LTR有啟動子和增強子并含負調控區。LTR之間的序列編碼了至少9個蛋白，可分為叁類:結構蛋白、調控蛋白、輔助蛋白。1.gag基因能編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白，經蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。2.Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。兩端是長末端重復序列(longterminalrepea493.env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120V3環上，V3環區是囊膜蛋白的重要功能區，在病毒與細胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內。實驗表明gp41亦有較強抗原性，能誘導產生抗體反應。3.env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp1504.TaT基因編碼蛋白可與LTR結合，以增加病毒所有基因轉錄率，也能在轉錄后促進病毒mRN

A的翻譯。5.Rev基因產物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應的病毒結構蛋白。4.TaT基因編碼蛋白可與LTR結合，以增加病毒所有基因轉51.Nef基因編碼蛋白P27對HIV基因的表達有負調控作用，以推遲病毒復制。該蛋白作用于HIvcDNA的LTR，抑制整合的病毒轉錄。可能是HIV在體內維持持續感集體所必需。7.Vif基因對HIV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產生和體內傳播。8.VPU基因為HIV-1所特有，對HIV的有效復制及病毒體的裝配與成熟不可少。.Nef基因編碼蛋白P27對HIV基因的表達有負調控作用，以529.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因結構與HIV-1有差別:它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。env基因表達產物激發機體產生的抗體無交叉反應。9.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內繁殖周期中53自1985年,美國食品藥品監督管理局批準使用第一代酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑以來,HIV的診斷得到了快速發展,現已從以前的單純HIV抗體檢測,發展到現在的抗原、核酸、CD4+、CD8+淋巴細胞計數、基因芯片技術等方法,大大縮短了檢出窗口期,提高了檢出率。自1985年,美國食品藥品監督管理局批準使用第一代酶聯免54近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。核酸檢測技術主要用于被高度懷疑有原發感染,且經抗體檢測之后抗體檢測陰性或不確定時;有高危行為或暴露史,特別是伴有相應臨床表現時,早期診斷主要用于個體檢測、血液篩查、HIV陽性產婦的嬰兒診斷。近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術55原位雜交技術應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測樣品中的HIV病毒靶核酸,初期為放射性標記,現在多以酶標記或化學發光試劑標記。原位雜交技術應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測樣品56HIV核酸定性檢測最常用的技術是聚合酶鏈反應(PCR)和逆轉錄PCR(RT-PCR)能在HIV感染1~14d的患者血漿中檢測到HIVRNA,可用于急性感染患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查,使HIV感染窗口期縮短至2周以內。HIV核酸定性檢測最常用的技術是聚合酶鏈反應(PC57尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義,前病毒DNAPCR檢測法對出生48h內的嬰兒檢測敏感性為38%,出生2周的嬰兒檢測敏感性達93%。尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中58HIV核酸定量檢測目前HIV核酸定量檢測技術主要有RT-PCR、分支DNA信號擴大系統(bDNA)、核酸序列依賴的擴增系統、轉錄介導的擴增系統(TMA)。HIV核酸定量檢測59基因芯片檢測技術該技術起始于20世紀90年代,通過對HIV基因組分析,將病毒的高度保守序列作為鑒定指標,將這些特定的寡核苷酸片段作為探針,有規律地排列于固相支持物上,然后與待測的標記樣品的基因進行雜交,經過計算機系統進行分析得出結果,后來應用到HIV實驗室檢測。

基因芯片檢測技術60HIV的實驗室檢測正朝著早期、快速、敏感、準確、自動化方向發展,相信不久的將來,一些新的技術會逐步應用到這一領域,使HIV的診斷和治療技術又上一個新的臺階。HIV的實驗室檢測正朝著早期、快速、敏感、準確、自動61臨床意義：早期診斷嬰兒診斷療效評價了解疫情臨床意義：62早期診斷；近年來,通過納米表面結合寡核苷酸構成納米顆粒基因探針,用于檢測靶脫氧核糖核酸。1、IS6110插入序列：僅見于MTBC.HIV核酸定性檢測最常用的技術是聚合酶鏈反應(PCR)和逆轉錄PCR(RT-PCR)能在HIV感染1~14d的患者血漿中檢測到HIVRNA,可用于急性感染患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查,使HIV感染窗口期縮短至2周以內。不加穩定劑病毒在-70℃冰凍下失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清在-70℃時冰凍3個月仍保持活性。小于105拷貝/ml,則日常生活密切接觸中幾乎沒有傳染危險性。gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內。HBVDNA拷貝數越高，病毒復制越厲害，傳染性越強，肝臟病理損害程度越高，肝組織炎癥反應越重。gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內。現已有商品化LiPA試劑盒，該試劑盒檢測配藥物敏感試驗結果的符合率為90.艾滋病病毒的消毒主要是針對被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、體液污染的醫療用品、生活場所等。判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。一般認為PZA是通過在菌體內被吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸而發揮作用。該藥與干擾素合用有協同作用。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)屬黃病毒科。病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對外界環境的抵抗力較弱，對乙肝病毒有效的消毒方法對艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長、死亡率高;病毒基因都復雜。已證明在LTR有啟動子和增強子并含負調控區。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120V3環上，V3環區是囊膜蛋白的重要功能區，在病毒與細胞融合中起重要作用。每個RNA的長度約為9.判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。（優選）感染性疾病分子診斷第二節病原菌的基因檢測 細菌廣泛分布于自然界。在人的體表和與外界相通的口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道等存在著不同種類和數量的細菌。人體免疫功能正常時，某些寄居在正常人體的細菌對人無害，屬于正常菌群。正常菌群與人體之間的平衡受某些條件的破壞可導致疾病，此時這些細菌為條件致病菌。另一些細菌因其本身所具有的毒性及侵襲力，一旦進入人體將會造成人體的感染，統稱為病原菌。

早期診斷；第二節病原菌的基因檢測63病原菌的診斷方法有直接涂片鏡檢、分離培養、生化試驗、血清學試驗和動物試驗等，但由于細菌培養周期較長等種種原因，尚不能令人滿意。分子診斷技術的應用將使細菌感染的診斷出現一個質的飛躍，同時可將分子診斷技術用于細菌分型、耐藥性的檢測中。病原菌的診斷方法有直接涂片鏡檢、分離培養、生化試驗、血清學試64一、淋球菌淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae,NG)，是淋病的病原菌。一、淋球菌65（一）細菌基因組結構淋球菌染色體可編碼約5000個基因，僅為大腸埃希菌基因組的1/3，其G+C含量為52%。（二）分子診斷方法1.PCR2.LCR可采用連接酶鏈式反應(ligasechainreaction,LCR)檢測淋球菌DNA。（一）細菌基因組結構66（三）臨床意義1.對分離培養的菌株進行鑒定和進一步分析。2.用于抗生素治療的療效觀察及監控。3.提高臨床標本檢測的陽性率和準確性。4.對淋球菌菌株進行分子流行病學分析。5.對疑為淋球菌引起的疾病的診斷和鑒別診斷具有決定性作用。（三）臨床意義67結核分枝桿菌

結核分枝桿菌1882年由RobertKoch發現，對人致病的主要是人型結核分枝桿菌，引起結核病。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應用等，結核病發病率逐年上升，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。盡管存在有效短程化學療法和卡介苗接種等方法防治，TB仍然是威脅人類生命最嚴重的感染性病原。1993年，WHO宣布結核病是一個全球性危機。結核分枝桿菌結核分枝桿菌1882年由RobertKoch68

目前臨床上常用的結核病診斷方法有細菌學涂片抗酸染色、活檢病理診斷和體液或組織培養。細菌學涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結核，但是陽性率很低，而且不能區別結核桿菌和不典型結核桿菌。另外麻風桿菌也可以表現為抗酸染色陽性。體液或活檢組織的分枝桿菌培養陽性可明確診斷結核及菌型，但是培養時間長，且陽性率非常低。雖然新的培養法BACTEC法顯著縮短了培養、菌型鑒定結果的報告時間，但由于該法使用放射性底物而使它的應用受到了限制。并且有些類型分枝桿菌不能在培養基中生長。目前臨床上常用的結核病診斷方法有細菌學涂片抗酸染色、活69結核病的歷史結核病的歷史70態生兩靨之愁嬌襲一身之病態生兩靨之愁嬌襲一身之病71結核病2006年全世界流行分布情況結核病2006年全世界流行分布情況721882年3月24日，羅伯特.科赫（RobertKoch）宣布發現結核桿菌-----世界防治結核病日結核桿菌1882年3月24日，羅伯特.科赫（RobertKoch73結核桿菌結核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學主要特點：1.結核分枝桿菌細胞壁中含有大量脂質2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性結核桿菌結核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學主74抵抗力

四怕乙醇濕熱紫外線抗結核藥物

四不怕干燥酸堿堿性染料青霉素等抗生素致病：致病物質

脂質①索狀因子②磷脂③硫酸腦苷脂(sulfatide)④蠟質D

蛋白質多糖抵抗力四怕乙醇濕熱紫外線抗結核藥物致75

感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機體所致疾病疾病種類多樣化以肺結核為主感染性疾病分子診斷課件761、直接涂片鏡檢傳統的微生物檢查1、直接涂片鏡檢傳統的微生物檢查772、濃縮集菌傳統的微生物檢查2、濃縮集菌傳統的微生物檢查783、分離培養傳統的微生物檢查3、分離培養傳統的微生物檢查79分子生物學快速診斷基因結構分子診斷臨床意義分子生物學快速診斷基因結構分子診斷臨床意義80TBH37Rv株的基因組為環形DNA。0點表示復制起始點。最外層代表穩定的RNA基因和直接重復區第二層示線性編碼序列第三層描述了重復DNA第四環標出了PPE家族的位置第五個環標出了PE家族的位置第六個環標出了PGRSs序列的位置最中心的直方圖表示了G+C含量基因結構TBH37Rv株的基因組為環形DNA。基因結構81

可采用PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR等方法檢測標本中的TBDNA。PCR擴增所選靶序列主要有65000抗原基因、MPB蛋白基因、tRNA基因、TBIS110插入序列、染色體DNA的重復序列等。擴增產物可用核酸雜交法進一步鑒定產物的特異性。PCR分子診斷可采用PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜82

應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.

另外幾個關鍵因素是:①DNA提取②TaqDNA聚合酶的活性③PCR產物的檢測方法具體步驟分子診斷應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性83技術步驟123TBDNA的提取引物的設計產物的檢測技術步驟123TBDNA的提取引物的設計產物的檢測84現在主要的細菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.DNA的提取方法主要有酚提取法和玻璃棒纏繞法一、結核桿菌DNA的提取技術步驟現在主要的細菌裂解方法是:一、結核桿菌DNA的提取技術步驟85根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計.常用的引物有：1、IS6110插入序列：僅見于MTBC.這種插入序列在基因組中的拷貝數為1--20個，選擇插入序列作為擴增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進行臨床PCR檢測的首選區段.2、16SrRNA序列3、DNA重復序列二、引物的設計技術步驟根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計86三、PCR產物的檢測方法通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，然后在紫外燈下觀察或進一步采用標記的DNA探針雜交.為了進一步提高檢測的靈敏度，現多在引物和探針的標記上進行改進.由于放射性標記物的危害性，現多采用非放射性標記，如生物素、熒光素、酶及化學發光劑.Wilson等在巢式PCR的內側引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.技術步驟三、PCR產物的檢測方法通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電87多重耐藥性結核病的產生原因。什么是耐多藥結核病？抗結核藥物分為一線藥物（如：異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等）和二線藥物（如：注射用類、氟喹諾酮類、口服抑菌類等）。多重耐藥性結核病的產生原因。什么是耐多藥結核病？抗結核藥物分88結核桿菌的分子耐藥機理

異煙肼(INH)

異煙肼通過抑制結核桿菌分枝菌酸的合成，造成細胞壁破損而殺菌。INH的耐藥性與一個或多個基因的多種突變有關。這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpC基因。結核桿菌的分子耐藥機理

異煙肼(INH)異煙肼通過抑制結核89

利福平(rifampin，RFP)利福平為一種廣譜抗菌藥物，它可與DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位結合，從而抑制mRNA的轉錄。在RFP耐藥結核桿菌rpoB基因中央附近69bp的高變區域內，存在35種以上不同的錯義突變，其中絲氨酸531→亮氨酸(ser531→Leu)和組氨酸526→酷氨酸(His526→Tyr)的兩種突變最常見，約占總突變65%以上。13%rpoB基因突變的RFP高度耐藥株仍對利福布丁(rifabutin)敏感，提示可采用利福布丁治療某些RFP耐藥的結核病。

利福平(rifampin，RFP)利福平為一種廣譜抗90鏈霉素(srreptomycin，SM)鏈霉素是抗結核治療中常用氨基糖甙類抗生素。SM耐藥性與編碼核糖體的二部分基因突變有關，它們是編碼16SrRNA的rrs基因和編碼S12蛋白的rpsL基因。rpsL基因是主要突變位點，其中密碼子43最常見，密碼子88較罕見。16SrRNA分子的環狀結構為次要突變點，即491，513，516，903核苷酸位點上。鏈霉素(srreptomycin，SM)鏈霉素是抗結核治療91乙胺丁醇(ethambutol，EMB)乙胺丁醇的抗菌活性僅局限于分枝桿菌，提示藥物靶位是一種分枝桿菌特有的結構，初步研究顯示emb基因編碼多種合成細胞壁阿拉伯聚糖必須的酶類，其中embAB基因編碼阿拉伯糖基轉移酶，embAB基因的突變或過度表達可導致持續合成阿拉伯聚糖而耐藥。

乙胺丁醇(ethambutol，EMB)乙胺丁醇的抗菌活性92

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)PZA作用機制和耐藥分子機理尚不清楚。一般認為PZA是通過在菌體內被吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸而發揮作用。分析結核桿菌和牛分枝桿菌PZA耐藥株，發現該酶活性顯著降低，提示酶活性喪失與耐藥密切相關。Scorpio等發現編碼吡嗪酰胺酶的pcnA基因是造成結核桿菌PZA耐藥的原因。

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)PZA作93氟喹諾酮類(fluoroquinolones，FQ)MDRTB的暴發流行使FQ成為最主要的二線抗結核藥物。FQ耐藥機理極其復雜，與耐藥發生有關因素包括(1)DNA旋轉酶，(2)拓撲異構酶Ⅳ，(3)細胞膜蛋白，它通過介導藥物的通透性和外流來調節胞內的藥物濃度。多個基因突變逐步累加是獲得高度耐藥性的基礎。FQ作用靶位是DNA旋轉酶，由gyrA和gyrB基因編碼的2個A亞單位和2個B亞單位組成。結核桿菌對FQ的耐藥與gyrA和gyrB基因突變有關。氟喹諾酮類(fluoroquinolones，FQ)MDR94結核桿菌耐藥基因的檢測方法

直接測序法耐藥區域PCR擴增，PRC擴增產物純化或克隆化取DNA片段直接測序，與標準敏感菌株的同一DNA片段比較，分析堿基突變的位置和分布。直接測序法是鑒定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應用。結核桿菌耐藥基因的檢測方法

95聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(PRC-SSCP)PCR-SSCP是檢測單堿基置換和數堿基缺失或插入的可靠而簡便方法，比直接DNA測序容易進行，而廣泛用作一種突變篩選方法。聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(PRC-SSCP)PCR96

固相雜交法探針雜交法是檢測耐藥基因突變的另一種快速簡便篩選方法。該方法可快速鑒定結核桿菌RFP耐藥株ropB基因的突變，適合于臨床標本的直接檢測。現已有商品化LiPA試劑盒，該試劑盒檢測配藥物敏感試驗結果的符合率為90.2%。

固相雜交法探針雜交法是檢測耐藥基因突變的另一種快速簡便篩971.能快速、早期、準確診斷TB感染臨床意義1.能快速、早期、準確診斷TB感染臨床意義982.可進行TB感染的分子流行病學調查、疫情監控和抗癆治療療效評價臨床意義2.可進行TB感染的分子流行病學調查、疫情監控和抗癆治療療99感染性疾病分子診斷感染性疾病分子診斷100（優選）感染性疾病分子診斷（優選）感染性疾病分子診斷101第十章感染性疾病的分子診斷分子診斷（moleculardiagnosis）是指通過檢測基因的結構異常或其表達異常，對人體的健康狀態和疾病作出診斷的方法。評估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料，而評估基因的表達量則以基因轉錄或翻譯的產物RNA/蛋白質分析來評估個體的生理/病理狀態。第十章感染性疾病的分子診斷102分子診斷技術主要包括核酸雜交聚合酶鏈式反應（PCR）基因芯片技術分子診斷技術主要包括103

感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統稱。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。

內源性感染：指由人體自身的正常菌群，在人體免疫功能下降時引起的感染，因為這些細菌必須在一定條件下才能致病，所以又稱為條件致病菌或機會致病菌，如腸道菌群中的大腸埃希菌、腸球菌等引起的感染多為內源性感染。

感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統稱。104分子診斷對感染性疾病可用于以下幾個方面：

適用不易培養的；種屬鑒定；早期診斷；動態監測；流行病學調查；基因分型；耐藥檢測。分子診斷對感染性疾病可用于以下幾個方面：105感染性病原體進行分子診斷，取決于兩個條件：一是在該病原體核酸中有特異的核酸序列（感染性病原體本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型這些保守序列的變異也很小，因此可以根據保守序列設計探針或引物）；二是能夠根據特異的核酸序列設計和制備具有特定信號的探針或設計合成相應PCR引物，多數感染性疾病的病原體都具備上述兩個條件。感染性病原體進行分子診斷，取決于兩個條件：106近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpC基因。還可通過對HCVRNA拷貝數的監測，評價干擾素和其他抗病毒藥物的療效。固相雜交法探針雜交法是檢測耐藥基因突變的另一種快速簡便篩選方法。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。種屬鑒定；定量檢測可判斷HCV的傳染性及病毒復制情況，進行病情評估、判斷病人預后。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。用于抗生素治療的療效觀察及監控。拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進程，終止肝硬化的發展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區突變的影響。疾病種類多樣化適用不易培養的；gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內。直接測序法耐藥區域PCR擴增，PRC擴增產物純化或克隆化取DNA片段直接測序，與標準敏感菌株的同一DNA片段比較，分析堿基突變的位置和分布。核酸檢測技術主要用于被高度懷疑有原發感染,且經抗體檢測之后抗體檢測陰性或不確定時;有高危行為或暴露史,特別是伴有相應臨床表現時,早期診斷主要用于個體檢測、血液篩查、HIV陽性產婦的嬰兒診斷。結核分枝桿菌1882年由RobertKoch發現，對人致病的主要是人型結核分枝桿菌，引起結核病。結核桿菌對FQ的耐藥與gyrA和gyrB基因突變有關。對艾滋病病毒的消毒可以根據消毒物品選擇適當的物理方法或化學方法。診斷策略可以分為以下兩種：一般性檢出策略完整檢出策略近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術107一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型別（包括變異株）和耐藥性方面的信息，因此，對于感染感染性疾病分子診斷一般性策略只是快速診斷是何種病原體的感染。一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型108

為了得到更多的疾病病原體信息，建議應該采取完整策略按照診斷→分型→亞型→耐藥性檢測的思路，利用多種分子診斷手段對感染性病原體進行分析。為了得到更多的疾病病原體信息，建議應該采取完整策略按109第一節病毒的基因檢測

人類許多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、腦炎、脊髓灰質炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根據病毒的核酸成分，可將其分為脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類。第一節病毒的基因檢測110一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，屬嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含內源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有獨特的復制方式，病毒合成以RNA中間體為模板，經反轉錄合成DNA鏈，在某些方面，HBV與逆轉錄病毒有許多相似性。

一、乙型肝炎病毒111

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,

據估計全球大約有20億人曾經感染乙肝病毒,慢性HBV感染者約315億~4億人,每年有50萬~120萬人死于HBV感染。我國是乙型肝炎的高發區,每年約有10%~20%的急性乙肝將轉成慢性肝炎,肝硬化甚至發展成肝癌,嚴重威脅著人們的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌變的發生機制是多年來肝病研究的重點。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,112HBV感染的病原學診斷免疫血清學檢測HBV的血清學標志物分子生物學方法檢測免疫學方法測定病毒抗體是一種快速簡便的檢測手段,常用的方法是間接ELISA,目前我國HBV檢測采用的第三代ELISA試劑由多種病毒抗原組合匹配,具有較好的靈敏性和特異性,但其在病毒感染的窗口期不能檢測到抗體,這在很大程度上限制了ELISA檢測的準確性,不能有效的控制病毒的傳播,因而,發展新的診斷HBV感染主要依賴分子生物學技術對病毒DNA的檢測。HBV感染的病原學診斷113感染性疾病分子診斷課件114（一）病毒基因組結構HBV是一種可感染人體、且具有獨立復制能力的雙鏈DNA病毒，具有以下幾個特點：①不完全雙鏈環狀結構；②利用重疊的開放讀碼框架(ORF)可編碼多個蛋白質；③所有調控序列均位于蛋白質編碼區；④基因序列具有多變性。HBV基因組是已知可感染人類又能獨立進行復制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的。

（一）病毒基因組結構115HBV基因組具有獨特的結構，是一個長約3.2kb的不完全雙鏈環狀DNA。雙鏈的長度不對稱，長鏈(L)因與病毒mRNA互補，定為負鏈；短鏈(S)為正鏈，5’末端固定，3’末端位置不固定，S正鏈的長度可為L負鏈的50~100%，因而在病毒群體中出現不同長度的正鏈與全長的負鏈匹配，故僅有部分基因組長度為雙鏈。HBV基因組L鏈上至少有4個ORF，分別稱為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。多個ORF重疊的結果使HBV本身3.2kb基因組序列的利用率高達150~200%。HBV基因組具有獨特的結構，是一個長約3.2kb的不完全雙116感染性疾病分子診斷課件117（二）分子診斷方法1．PCR

2.支鏈DNA技術3.核酸雜交4.基因芯片技術（二）分子診斷方法118逆向斑點雜交法原理就是將各種探針固定在基質上,用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。逆向斑點雜交法119FeO/Au納米顆粒探針法近年來,通過納米表面結合寡核苷酸構成納米顆粒基因探針,用于檢測靶脫氧核糖核酸。其原理是利用DNA堿基嚴格互補配對的特性設計的,主要應用于分子的組裝。FeO/Au納米顆粒探針法120衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來自宿主細胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉錄的引物)。判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。第十章感染性疾病的分子診斷對艾滋病病毒的消毒可以根據消毒物品選擇適當的物理方法或化學方法。Vif基因對HIV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產生和體內傳播。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應用等，結核病發病率逐年上升，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。當停止應用拉米夫定治療后，野生株通常會替代變異株。這些基因包括編碼觸酶-過氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過氧化物還原酶的ahpC基因。該方法可快速鑒定結核桿菌RFP耐藥株ropB基因的突變，適合于臨床標本的直接檢測。5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。可采用PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR等方法檢測標本中的TBDNA。現已有商品化LiPA試劑盒，該試劑盒檢測配藥物敏感試驗結果的符合率為90.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉錄激活物，在體內繁殖周期中起一定作用。種屬鑒定；細菌學涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結核，但是陽性率很低，而且不能區別結核桿菌和不典型結核桿菌。近年來,隨著分子生物學技術的快速發展,應用分子生物學技術檢測HIV的核酸已經成為HIV實驗室診斷的重要發展方向。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)屬黃病毒科。一般認為PZA是通過在菌體內被吡嗪酰胺酶轉化為吡嗪酸而發揮作用。HBVDNA拷貝數越高，病毒復制越厲害，傳染性越強，肝臟病理損害程度越高，肝組織炎癥反應越重。應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的全球問題,

聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法該法利用錯配PCR的原理擴增HBV前C區長194bp,C啟動子區長184bp的基因片段,擴增產物分別經限制性內切酶Bsu361,Bc1I酶切,瓊脂糖凝膠電泳,根據酶切圖譜多態性,建立檢測HBV前CA1896,BCPT1762/A1764雙變異的方法,衣殼內含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)121乙型肝炎病毒DNA等溫擴增技術HBV的病毒載量與感染狀態密切相關,尋求快速、簡便、靈敏、特異的定量手段是對HBV早期診斷、病程監控及流行病學調查的需求。乙型肝炎病毒DNA等溫擴增技術122（三）臨床意義1．HBV感染的早期診斷

2.監測治療效果

3.判斷病情，指導制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測是判斷病毒復制情況的指標。HBVDNA拷貝數越高，病毒復制越厲害，傳染性越強，肝臟病理損害程度越高，肝組織炎癥反應越重。4.在乙型肝炎病毒耐藥檢測中的應用（三）臨床意義123HBVDNA檢測是乙肝病毒抗病毒治療的有效監測指標。乙肝病毒藥物治療后,HBVDNA含量持續下降,然后持續在低水平,或低至方法學能檢出的含量(測定下限)以下,則說明治療有效。觀測抗病毒藥物治療效果不能憑兩三次檢測結果來判斷,必須多次動態觀察,每次檢測的間隔天數不宜太短,一般為兩周以上。可采用以檢測次數為橫坐標,HBVDNA量為縱坐標作圖的方法來判斷血清HBVDNA量的變化趨勢,進而判斷抗病毒治療是否有效。血循環中HBVDNA濃度與HBsAg和HBeAg有一定的相關,但其濃度間并不呈正線性相關。HBVDNA檢測是乙肝病毒抗病毒治療的有效監測指標。乙肝124拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進程，終止肝硬化的發展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區突變的影響。該藥與干擾素合用有協同作用。拉米夫定作為新一代核苷類高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV125長期服用拉米夫定會引起HBV基因突變而造成耐藥，其中95%是由于HBV基因組P區中高度保守的YMDD功能區（Y酪氨酸—M甲硫氨酸—D天冬氨酸--D天冬氨酸）發生突變：第552位甲硫氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）代替，突變后的HBV稱為YVDD變異株和YIDD變異株。由于變異造成基因組核苷酸與DNA多聚酶的結合能力有降低