30十一月20221celluloseacetatemembraneelectrophoresis實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳30十一月20221celluloseacetate30十一月20222【實驗目的】

掌握電泳法分離血清蛋白質的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義30十一月20222【實驗目的】掌握電泳法分離血清蛋30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現象電泳技術：利用電泳現象對混合物進行分離分析的技術【實驗原理】30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pI30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質的粘度30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：

I越大，電動電勢越小，u越小；

I越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定

選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。

電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產熱也增加，影響分離效果。在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質等樣品發生熱變性而無法分離30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降30十一月202294.支持介質：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)30十一月202294.支持介質：①纖維薄膜(玻璃纖維薄30十一月202210負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:30十一月202210負極正極－－－－－－－30十一月202211區帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。30十一月202211區帶電泳的分類30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電30十一月202213(三)pH連續性：1．連續pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等30十一月202213(三)pH連續性：30十一月202214

醋酸纖維薄膜為支持物

pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6

負電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離30十一月202214醋酸纖維薄膜為支持物30十一月202215γβα2α1清蛋白

分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快30十一月202215γβα30十一月202216膜條經過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質含量與染料結合量基本成正比。可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質的百分數。30十一月2022162.定性,定量30十一月202217醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜廣泛應用醫學臨床各種生物分子的分離分析

血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等30十一月202217醋酸纖維薄膜：血清蛋白、血紅蛋30十一月202218優點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）30十一月202218優點：30十一月202219【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液30十一月202219【器材及試劑】1、器材：2、試劑：30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準備3、電極槽的平衡30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、30十一月202221（二）點樣

取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區距陰極端1.5cm

血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內形成一定寬度、粗細均勻的直線

實驗的關鍵，是獲得具有清晰區帶的電泳圖譜的重要環節30十一月202221（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上30十一月202222（三）電泳

點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min

打開電源開關，調節電流強度為0.3mA/片，通電10min

調節電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調節旋鈕電流為O，關閉電泳儀切斷電源30十一月202222（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳30十一月202223DYY-5型穩壓穩流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽30十一月202223DYY-5型穩壓DYY-Ⅲ型30十一月20222430十一月20222430十一月20222530十一月20222530十一月202226【實驗注意事項】

不要用手觸摸纖維素膜注意區分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內，不要距邊緣太近不要重復點樣膜放進電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極30十一月202226【實驗注意事項】不要用手觸摸纖30十一月202227

用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液30十一月202227用點樣器點樣時不要點的太多，但也30十一月202228（四）染色和漂洗

取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜30十一月202228（四）染色和漂洗取出薄膜，直接30十一月202229【實驗結果】繪出電泳圖譜并標明各條帶含義30十一月202229【實驗結果】繪出電泳圖譜并標明各條30十一月20223030十一月20223030十一月202231臨床意義

血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％30十一月202231臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的30十一月202232可能相關疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關系：正常人A/G＝1.5～2.530十一月202232可能相關疾病清蛋白α1球蛋白α2球30十一月202233血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠體滲透壓調節血漿pH值，維持酸堿平衡運輸營養物質、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用30十一月202233血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體30十一月202234白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴重燒傷，大出血等

消耗過多：糖尿病，甲亢等30十一月202234白蛋白降低：30十一月202235球蛋白增加：感染，多發性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質功能亢進，免疫缺陷病30十一月202235球蛋白增加：球蛋白降低：30十一月202236肝病：A,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎病：早期：選擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質丟失，含量下降分子量較大的蛋白質（如γ-球蛋白）丟失，含量下降30十一月202236肝病：腎病：30十一月202237【實驗思考】1．電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？2．電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質？各譜帶為何種成分？請分析原因30十一月202237【實驗思考】1．電泳時，點樣端置于30十一月202238【常見問題及原因】1.電泳圖譜不齊：點樣時血清滴加不均2.電泳圖譜出現條痕：點樣后薄膜過干，或電泳槽密閉性不良，或電流過大，造成水分蒸發薄膜干燥3.分離不良：標本滴加過多4.區帶過于緊密：緩沖液離子強度大于0.07530十一月202238【常見問題及原因】1.電泳圖譜不30十一月2022395.區帶拖尾：緩沖液離子強度小于0.056.染色后清蛋白中間色淺：染色時間不足，或清蛋白量過高減少樣品用量或延長染色時間30十一月2022395.區帶拖尾：緩沖液離子強度小于030十一月202240celluloseacetatemembraneelectrophoresis實驗四血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳30十一月20221celluloseacetate30十一月202241【實驗目的】

掌握電泳法分離血清蛋白質的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義30十一月20222【實驗目的】掌握電泳法分離血清蛋30十一月202242電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現象電泳技術：利用電泳現象對混合物進行分離分析的技術【實驗原理】30十一月20223電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與30十一月202243H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI30十一月20224H＋OH－H＋OH－pH>pI30十一月202244電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質的粘度30十一月20225電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單30十一月202245影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；30十一月20226影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子30十一月2022462.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：

I越大，電動電勢越小，u越小；

I越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定

選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。30十一月202272.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)30十一月202247電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。

電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產熱也增加，影響分離效果。在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質等樣品發生熱變性而無法分離30十一月20228電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降30十一月2022484.支持介質：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)30十一月202294.支持介質：①纖維薄膜(玻璃纖維薄30十一月202249負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:30十一月202210負極正極－－－－－－－30十一月202250區帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。30十一月202211區帶電泳的分類30十一月202251（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳30十一月202212（二）支持物裝置形式：1．平板式電30十一月202252(三)pH連續性：1．連續pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等30十一月202213(三)pH連續性：30十一月202253

醋酸纖維薄膜為支持物

pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6

負電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離30十一月202214醋酸纖維薄膜為支持物30十一月202254γβα2α1清蛋白

分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快30十一月202215γβα30十一月202255膜條經過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質含量與染料結合量基本成正比。可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質的百分數。30十一月2022162.定性,定量30十一月202256醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜廣泛應用醫學臨床各種生物分子的分離分析

血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等30十一月202217醋酸纖維薄膜：血清蛋白、血紅蛋30十一月202257優點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）30十一月202218優點：30十一月202258【器材及試劑】1、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液30十一月202219【器材及試劑】1、器材：2、試劑：30十一月202259[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準備3、電極槽的平衡30十一月202220[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、30十一月202260（二）點樣

取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區距陰極端1.5cm

血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內形成一定寬度、粗細均勻的直線

實驗的關鍵，是獲得具有清晰區帶的電泳圖譜的重要環節30十一月202221（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上30十一月202261（三）電泳

點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min

打開電源開關，調節電流強度為0.3mA/片，通電10min

調節電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調節旋鈕電流為O，關閉電泳儀切斷電源30十一月202222（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳30十一月202262DYY-5型穩壓穩流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽30十一月202223DYY-5型穩壓DYY-Ⅲ型30十一月20226330十一月20222430十一月20226430十一月20222530十一月202265【實驗注意事項】

不要用手觸摸纖維素膜注意區分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內，不要距邊緣太近不要重復點樣膜放進電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極30十一月202226【實驗注意事項】不要用手觸摸纖30十一月202266

用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液30十一月202227用點樣器點樣時不要點的太多，但也30十一月202267（四）染色和漂洗

取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜30十一月202228（四）染色和漂洗取出薄膜，直接30十一月202268【實驗結果】繪出電泳圖譜并標明各條帶含義30十一月202229【實驗結果】繪出電泳圖譜并標明各條30十一月20226930十一月20223030十一月202270臨床意義

血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％30十一月202231臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的30十一月202271可能相關疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低