不同品種肉牛H-FABP基因3‘UTR擴增及潛在肌肉生長發育microRNA甄選摘要：根據GeneBank中心臟型脂肪酸結合蛋白（H-FABP)基因序列（NC-007300），設計并合成了2對引物，以6個品種牛肌肉組織DNA為模板，采用PCR技術用第一對引物擴增牛的H-FABP的3′-UTR基因全長858bp，再用第二對引物根據巢式PCR進行擴增基因全長261bp，并克隆、測序，最后進行mircoRNA預測、分析。這6個品種牛的H-FABP基因的成功克隆，為進一步研究牛肌內組織沉積研究奠定了基礎。關鍵詞：心臟型脂肪酸結合蛋白基因；SNP；mircoRNA；CloningandMolecularCharacteristicsofH-FABPGeneinsixkindofCattlewithIdentificationofPotentialFunctionalMicroRNAforMuscleGrowthDUXin,FANGXue-song,ZhangLi-jun,BAIWen-lin,WANGZhe-ying,LUOGuangbin(Collegeofanimalhusbandryandveterinarymedicine,ShenyangAgricultureUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)Abstract:Twopairofprimersweredesignedandsynthesizedaccordingtothebovineinterferonbatal(H-FABP)genenucleicacidsequence(NC-007300)publishiedinGenBank.H-FABPgeneofthesixkindbovinewasamplifiedbyPCRfromgenomeDNAextractedfrommuscleofthebovine,first,weusethefirstpairofprimerstoamplificatethe3'UTRofH-FABP,thetotallongis85bbp,thenweusethesecondpairofprimerstoamplificatethe3'UTRofH-FABPfurther,thenclonedandsequenced,predictedandanalizedultimatelly.Thisstudysetabasisforthefuturestudyaboutdepositionofbeefintramuscular.Keywords:thegeneofH-FABP;sequenceanalysis;intramuscularofbovine牛肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點，營養豐富，一直是世界肉業發達國家肉類消費的首選，而我國的牛肉消費量也在逐年上升，影響牛肉品質的因素眾多，脂肪是肉品質的一個重要組成部分并且影響動物的產量[1,2]。脂肪的生成是一個復雜的過程，有900多個數量性狀的候選基因對脂肪沉積進行調控[3]。國內外對其進行了廣泛而深入的研究。其中H-FABP就是控制肌內脂肪的一個基因。心臟型脂肪酸結合蛋白(HeartFattyAcid-BindingProtein,H-FABP)是1972年發現的，又被稱為FABP3，分子量為14-15kDa。H-FABP是FABPs家族中分布最多的一種。由于H-FABP基因管理脂質和脂肪酸的轉運和沉積，因此H-FABP與脂肪特性相關。除此之外，H-FABP基因與IMF含量的遺傳變異相關。H-FABP基因主要是參與細胞內的脂肪酸運輸，將脂肪酸從細胞膜上運到脂肪酸氧化和三酰甘油及磷脂的合成位置。H-FABP在細胞內與脂肪酸結合，使細胞內外保持一定的濃度差，促進細胞攝取脂肪酸[4]。microRNAs與脂代謝密切相關，越來越多的研究表明，miRNAs可以通過與脂類代謝相關基因靶位點結合在轉錄后水平參與調節脂肪酸和膽固醇等多個層面的脂類代謝。目前,關于肌肉發育的機制還不是很清楚,但是在肌細胞的增殖、分化過程中許多調節因子都發揮著重要作用,microRNAs也在其中發揮重要的調節作用。miRNA的結合位點通常位于mRNAs的3’UTR（非翻譯區域）[5]。RNA沉默中，miRNA的功能是通過堿基配對與靶mRNAs結合后作為其結合物的向導[6]。在mRNAs的5’端包括2-7位置的區域的核苷酸對于靶標結合是相當關鍵的，并且已經被定義是miRNA種子序列。miRNA的下游核苷酸序列（尤其是8核苷酸和13-16位置的核苷酸同樣重要）也同樣與靶mRNA堿基配對結合。1實驗材料1.1肌肉組織樣品在遼寧綠源肉業有限公司所屬的屠宰場采集遼寧省畜牧業經濟管理站提供的平均年齡約為5歲的本地黃牛、夏洛萊牛、利木贊牛、延江牛、遼育白牛和利復牛等6頭種公牛牛肋脊部肌肉組織，用提前經過滅菌的鑷子和手術刀片分別取100g并切成小塊分裝，裝在紗布袋里，拴好并在繩上粘上標簽，立即放入液氮罐中冷凍備用。1.2儀器與設備臺式高速離心機、旋渦混合器、微波爐、高壓電泳儀、應變式電子天平、制冰機、自動電熱壓力蒸汽滅菌器、PCR儀、凝膠成像系統、數顯恒溫電熱水浴鍋、穩壓穩流電泳儀、水平電泳槽、生物超凈工作臺、數碼凝膠成像與分析系統、漩渦震蕩儀、電子天平、三重蒸餾水器、自動電熱壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓、風干燥箱、移液器、超純水儀等均有沈陽農業大學提供。2實驗方法2.1引物設計在NCBI數據庫找到牛H-FABP基因序列（登錄號為NC_007300.5），利用Primer5.0引物設計軟件，再用軟件Oligo6進行引物評估，對3′-UTR設計特異引物，由上海生工合成引物。依據引物設計原則，進行巢式PCR對7種牛的H-FABP基因所用引物如表1所示：表1H-FABP基因3′調控區目的片段擴增引物Table1Primersfor3′controlregionofPCRproductsofH-FABP引物序列產物退火溫度方法3H1F:AGAACTAAATACTTGCTGGGR:AGACACAATGAGAACGGAAC858bpTMPCR-Sequence3H2F:TTTGCACTCGTACTTACR:CTTGGCTCTGCTTTATT261bpTMPCR-Sequence2.2基因組DNA的提取及檢測依照天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的方法步驟進行DNA提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度：取2μL基因組DNA樣品，在80V電壓條件下，采用1％瓊脂糖凝膠電泳30-60min左右。在紫外燈下觀察電泳結果，并檢測基因組DNA的完整性。2.3產物擴增本實驗針對DNA基因位點，建立25μL的基本PCR反應體系。H-FABP基因引物3H1、3H2的PCR總反應體系包括：12.5mmol/LMASTERMixture、1μL上游和下游引物（20mmoL/L）、2μL模版DNA，最后加8.5μL滅菌超純水至25μL。PCR運行程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，退火30s（需要經過梯度PCR儀設置溫度梯度，來尋找各PCR引物最佳退火溫度），72℃延伸1min，35個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴增產物為預期目的條帶，并特異性良好后，進行后續分析。2.4序列鑒定擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，取2L擴增產物，點樣后進行凝膠實驗（1%瓊脂糖凝膠），同時加2LMarker作參照，在120V電壓條件下，電泳20min左右。電泳結束后，凝膠成像儀檢測目的條帶后拍照，標記，送樣到生物工程單向測序。將目的序列與GenBank中相應基因序列進行比對分析，從而實現基因的序列結構確定。然后利用DNAStar，DNAMAN4.0，BLAST等軟件與GenBank中序列進行比較分析。2.5序列分析利用數據庫和在線軟件預測3′端非翻譯區序列靶標MicroRNA：①TargetScan（http://www.T/），靶標MicroRNA核心種子區序列結合程度鑒定。②RNAhybri（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）MicroRNA結構分析。3H-FABP基因提取與檢測3.1組織中DNA樣品的檢測本實驗采用DNA試劑盒從6種牛組織中提取H-FABP基因組DNA，基因組DNA組織樣共提取30份。取1μL基因組DNA溶液，在120V電壓條件下電泳20min，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1所示，從圖中可以看出，各泳道都有清晰的條帶，沒有拖尾現象。說明本實驗提取的牛H-FABP基因組DNA符合實驗要求，可用于后續工作。圖1DNA產物瓊脂糖凝膠電泳結果從右到左依次為M、1為黃牛、2為利復牛、3為利木贊牛、4為夏洛萊牛、5為遼育白牛、6為延江牛Fig.1ResultsofagarosegelelectrophoresisforDNAproductsFromrighttoleftisyellowcow、lifucow、limuzancow、xialuolaicow、liaoyuwhitecow、yanjiangcow3.2最適退火溫度用引物H1分別對6種牛的DNA模板設置溫度梯度擴增，夏洛萊牛的最適溫度為56.8℃,遼育白牛的為56.8℃、利木贊牛的為55.7℃、本地黃牛的為56.5℃、利復牛的為53.6℃、沿江牛的為56.8℃；同樣用引物H2分別對6種牛的相同的H1所得PCR產物與6種牛DNA模板1:1比例混合物為模板設置溫度梯度擴。對應的溫度夏洛萊萊牛的為53.1℃，遼育白牛的為58.2℃、利木贊牛的為58.2℃、本地黃牛的為54.4℃、利復牛的為57.0℃、沿江牛的為57.0℃。3.3目的基因片段擴增與測序本實驗采用設計的上、下游特異引物，分別在各自最適退火溫度條件下獲得H-FABP基因各個區段目的片段（圖2、圖3）。編碼區的引物H1，H2對基因擴增時，采用的模板是不同牛血液和組織中提取的DNA。用H-FABP基因的3′-UTR區域的基因引物進行基因擴增時，需要對不同種公牛組織樣提取的DNA分別進行擴增。然后根據巢式PCR方法，將檢測后成功獲得的H-FABP基因的3′-UTR區域基因擴增產物按1：1比例混勻，將所有成功獲得的H-FABP基因擴增產物進行測序圖4。測序結果顯示，3′-UTR區170bp處有差異。圖2H-FABP基因PCR擴增產物圖3H-FABP基因PCR擴增產物Fig.2PCRproductsofH-FABPgeneFig.3PCRproductsofH-FABPgene圖4H-FABP基因3′-UTR序列Fig.43′-UTRsequenceofH-FABPgene4結果與分析獲得的目的序列要提交到GenBank中，將這6個品種的牛H-FABP與普通牛的對應H-FABP基因序列比對。當分析確定最終獲得的基因序列結構與預期一致，用DNAStar，BLAST，DNAMAN4.0等分析比對軟件。4.1不同品種牛H-FABP測序序列同源性分析觀察發現，首先遼育白牛與利復牛測序序列的一致性為99%，利木贊牛和夏洛萊牛測序序列的一致性為99%，沿江牛和他們這兩支的同源性達到98%，,最后與黃牛的一致性達到97%，最后這幾分支一起與普通牛相比同源性達到96%（圖5）。圖56個品種牛H-FABP基因同源樹Fig.5SixcowhomologytreeofH-FABPprotein4.3H-FABP基因3′-UTR生物信息學特征測序后通過基因序列與波峰的比對發現，在H-FABP基因3′-UTR區發現了1個差異位點，170bp位點A/C的突變（圖6）。圖6H-FABP基因中SNP的峰圖Fig.6PeakprofileofSNPsinH-FABPgene4.4H-FABP靶標miRNA結構使用RNAhybrid分析miRNA二級結構，bta-miR-138序列為5′-agcugguguugugaaucaggccg-3′，且長度為23bp，其靶標前體長度為47bp，mfe值為-28.4。（圖9）圖7MiRNA-138結構的特征Fig.7StructureofmiRNA-1385討論結果表明：從最開始的采樣到DNA的提取，經瓊脂糖凝膠電泳檢測6個品種牛的DNA樣均可進行下一步操作，經PCR測序后進行一系列分析可知這6個品種的牛的H-FABP基因的靶標miRNA-138結構相同。脊椎動物肌肉的生長主要依賴于肌纖維的增殖和肥大,即肌纖維的數量和大小。胚胎期肌細胞經反復的有絲分裂,大量增殖。出生后動物肌纖維的數目不再增加，因而此后肌纖維的生長主要依賴于體積的增加和肌纖維的增長[7]。H-FABP在畜禽遺傳育種及臨床醫學中均有應用。在動物遺傳育種中，有研究表明，H-FABP與畜禽肌內脂肪含量呈正相關，影響肉質的嫩度，風味和多汁性，故將H-FABP基因作為改善肉質的候選基因之一[8]。從遺傳的角度來講，H-FABP基因的缺陷會嚴重影響脂肪酸的攝取和氧化[9]。miRNAs是一類非編碼的且具有導向功能的小分子RNAs，microRNA是一類長度約22nt的內源性非編碼小RNA分子[10]，它能夠通過與靶基因3′非翻譯區結合從而抑制靶基因的翻譯或降解靶基因[11]。miRNA參與復雜的生物學過程。隨著對miRNA的深入研究，我們發現microRNA是基因表達的監管機構，抑制轉錄后的mRNA進行翻譯[12]。目前，在miRNABase數據庫中公布了686個牛的miRNA，它們的功能主要是通過與靶基因的3’UTR區互補配對[13-15]，根據互補配對程度高低進行切割或翻譯抑制[16]，間接調節與機體生長，發育，疾病發生相關基因的表達，具有階段性和組織特異性[17,18]。[1]DodsonMV,JiangZ,ChenJ,HausmanGJ,GuanLL,NovakofskiJ,Thompson,DP,LorenzenCL,FernyhoughME,MirPS,ReecyJM:Alliedindustryapproachestoalterintramuscularfatcontentandcompositioninbeefanimals.JFoodSci2010,75(1):R1–R8.[2]HausmanGJ,DodsonMV,AjuwonK,AzainM,BarnesKM,GuanLL,JiangZ,PoulosSP,SainzRD,SmithS,SpurlockM,NovakofskiJ,FernyhoughME,BergenWG:Board-invitedreview:thebiologyandregulationofpreadipocytesandadipocytesinmeatanimals.JAnimSci2009,87(4):1218–1246.[3]M.Tyra,K.Ropka-Molik,A.Terman,etal.Associationbetweensubcutaneousandintramuscularfatcontentinporcinehamandloindependingonage,breedandFABP3andLEPRgenestranscriptabundance[J].MolecularBiologyReports,2011,40(3):2301-2308.[4]曲桂娟；祁宏偉；孟軻音.肉牛肌內脂肪沉積相關基因的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫,2013,11(21):30-33.[5]Bartel,

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