1、環(huán)境工程微生物學(xué)實驗報告實驗名稱：總大腸菌群的檢驗專 業(yè)：環(huán)境科學(xué)班 級：環(huán)科111學(xué) 號：1108100069學(xué)生姓名：余永浩指導(dǎo)教師：錢曉莉?qū)嶒炄掌?_2013415-2013419一、實驗名稱總大腸菌群的檢驗二、實驗?zāi)康模?）了解總大腸菌群的數(shù)量指標(biāo)在環(huán)境領(lǐng)域的重要性，學(xué)會總大腸 菌群的檢驗方法。（2）通過檢驗過程，了解大腸菌群的生化特性。三、實驗原理人的腸道中主要有3大類細(xì)菌：大腸菌群（G-菌）：腸球菌 （G+菌）：產(chǎn)氣莢膜桿菌（G+菌）。由于大腸菌群的數(shù)量最大，在體 外存活時間和腸道致病菌相近，且檢驗方法比較簡單，所以被定為檢 驗?zāi)c道致病菌的指示菌。總大腸菌群包括腸桿菌科中的埃希氏菌

2、屬（模式種：大腸埃希氏 菌）、檸檬酸細(xì)菌屬、克雷氏菌屬及腸桿菌屬。這4種菌屬都是兼性 厭氧、無芽孢的革蘭氏陰性桿菌（G-菌），他們的生化反應(yīng)特點已在 微生物的生理章節(jié)中介紹。大腸菌群的檢測方法主要有多管發(fā)酵和濾膜法。前者被稱為水的 標(biāo)準(zhǔn)分析法，即將一定量的樣品接種到乳糖發(fā)酵管，根據(jù)發(fā)酵反應(yīng)的 結(jié)果，確證大腸菌群的陽性管數(shù)后在檢索表中查處大腸菌群的近似值。 后者是一種快速的替代方法，能測定大體積的水樣，但至局限于飲用 水或較為干凈的水，目前在一些大城市的水廠采用此法。四、實驗儀器及其材料（一）器皿顯微鏡、錐形瓶（500ml） 1個、試管（18mmX180mm） 6或7支、 大試管（容積150ml

3、）2支、移液管1ml2支及10ml 一支、培養(yǎng)皿10 套、接種環(huán)、試管架一個（二）試劑、材料（1）化學(xué)藥品：蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、瓊脂、無水亞硫酸 鈉、牛肉膏、氯化鈉、質(zhì)量濃度16g/L的溴甲酚紫乙醇容溶 液、質(zhì)量濃度50g/L的堿性品紅溶液、質(zhì)量濃度20g/L的伊 紅水溶液、質(zhì)量濃度5g/L的亞甲藍(lán)水溶液（2）采集于貴大新校區(qū)的生活污水（3）革蘭氏染色液一套：草酸鉉結(jié)晶紫、革蘭氏碘液、體積分?jǐn)?shù) 為95%的乙醇、番紅染液。（4）其他：100g/L的氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)10%的HCl、pH試紙五、實驗步驟: （一）配制培養(yǎng)基：（4月15日）乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵的復(fù)發(fā)酵使用）配方：蛋白胨

4、10克、牛肉膏3克、乳糖5克、氯化鈉5克、溴甲酚 紫乙醇溶液（16g/L） 1mL、蒸餾水1000 mL制備：將蛋白陳、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調(diào)整pH為 7.27.4,再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于 裝有倒管的試管中，每管10mL, 68.95kPa （115C, 10lb）高壓滅菌 20min，取出后置于陰冷出備用。三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵的初復(fù)發(fā)酵使用）按照乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的配方和制法，除蒸餾水外，其他成分量 濃縮三倍。品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（即遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基）該培養(yǎng)基供多管發(fā)酵的平板畫線使用。（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二

5、鉀3.5g、瓊脂20g、 蒸餾水1000mL、無水硫酸鈉5g、50g/L的品紅乙醇溶液20mL。（2）制備：先將瓊脂加入900mL蒸餾水中加熱溶解，然后加入磷 酸氫二鉀和蛋白胨，混勻使之溶解，補足失水到1000mL，調(diào) 整pH為7.2-7.4,趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖， 混勻后定量分裝于錐形瓶中，包裝后滅菌。伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基（1）配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂 20g30g、蒸餾水1000ml、伊紅水溶液（20g/L）20mL、亞甲藍(lán)水 溶液（5g/L）13mL。（2）制備：與品紅亞硫酸鈉的制備過程相同，瓊脂加入900mL蒸餾水中加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀和

6、蛋白胨，混勻，補足 失水到1000mL調(diào)整pH為7.2-7.4趁熱用脫脂棉過濾，再加 入乳糖，混勻后裝于錐形瓶中，滅菌。（二）測定步驟：（4月17日）多管發(fā)酵法（1）按要求配制乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、三陪濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基、伊紅-亞甲藍(lán)培養(yǎng)基。（2）初發(fā)酵試驗：在2支各裝有50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 的大發(fā)酵管中，以無菌操作各加入水樣100mL。在10支各裝有5mL 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，以無菌操作各加入10mL水 樣，混勻后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣的情況。（3）確定性試驗：用平板劃線分離，將經(jīng)培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸的發(fā)酵管 取出，無菌操作，用接種環(huán)挑取一環(huán)發(fā)酵液于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平 板上劃線分離，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824h，觀察菌落特征。（4）復(fù)發(fā)酵實驗：無菌操作，用接種環(huán)挑取具有培養(yǎng)基平板上菌落的特征的菌落于裝有 10mL普通濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，每管可接種同一平板上的13個典 型菌落的細(xì)菌，于37r恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。觀察。六、實驗結(jié)果及其分析討論：（1）在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板上的菌落特征：a:紫紅色，具有金屬光澤的菌落；b：深紅色，不帶或者略帶金屬光澤的菌落；c：淡紅色，中心色較深的菌落。（2）在伊紅一亞甲藍(lán)培養(yǎng)基平板上的菌落特