1、CML患者CD4+和CD8+T細(xì)胞的TCR V基因譜系和克隆性【關(guān)鍵詞】慢性粒細(xì)胞白血病t細(xì)胞的克隆性trv亞家族基因掃描analysisftrvrepertireandlnalityfd4+andd8+tellsinpatientsithlinstitutefheatlgy,edialllege,jinanuniversity,guangzhu510632，hinakeyrdshrniyelgenusleukeia；tellslnality；trvsubfailies；genesananalysis1材料與方法1.1標(biāo)本經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組化和細(xì)胞及分子遺傳學(xué)確診的慢性期l患者19例男12例

2、，女7例，中位年齡26歲1575歲。別離外周血單個(gè)核細(xì)胞pb，其中部分細(xì)胞利用d4、d8單抗iltenyibite,gerany和免疫磁珠分選法as分選d4+和d8+t細(xì)胞按產(chǎn)品說(shuō)明操作。同時(shí)搜集14例正常人外周血標(biāo)本作對(duì)照。1.2rna提取和dna合成根據(jù)細(xì)胞數(shù)分別采用trizl試劑盒310610106個(gè)和qiagenrneasyinikit3106個(gè)提取rna后，應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒supersriptii,gib,brl反轉(zhuǎn)錄合成dna第一鏈，按常規(guī)方法進(jìn)展。1.4t細(xì)胞克隆性分析2結(jié)果正常人外周血d4+和d8+t細(xì)胞幾乎表達(dá)全部24個(gè)v亞家族，均呈多克隆性增殖，見(jiàn)圖1。l患者那

3、么不同，均選擇性表達(dá)部分v亞家族，d4+和d8+細(xì)胞表達(dá)情況比擬類似，見(jiàn)圖2。均表達(dá)121個(gè)v亞家族，以v13的表達(dá)率最高18/19例，94.74%，其次為v9，最低的分別為v201/19例，占5.26%和v173/19例，占15.79%。而患者pbs中平均僅表達(dá)5.89個(gè)v亞家族，2例患者24個(gè)v亞家族全部缺失，3例僅表達(dá)1個(gè)v亞家族，最多者表達(dá)14個(gè)。基因掃描分析顯示73.7%14/19例的l患者d4+細(xì)胞亞群有14個(gè)亞家族出現(xiàn)不同程度的克隆性增殖t細(xì)胞，這些克隆性增殖的t細(xì)胞分布在14個(gè)亞家族中，以v21克隆性增殖最常見(jiàn)，存在于36.84%7/19例的病人，其它亞家族中克隆性增殖的t細(xì)胞

4、多見(jiàn)于12例病人。而在d8+細(xì)胞中，不管是出現(xiàn)克隆性增殖t細(xì)胞的例數(shù)還是不同病例克隆性增殖t細(xì)胞分布的亞家族數(shù)都較d4+增多，見(jiàn)圖3。89.5%17/19例病人出現(xiàn)多少不等15個(gè)亞家族的克隆性t細(xì)胞，這些克隆性增殖的t細(xì)胞分布于20個(gè)v亞家族，以v11的克隆性增殖最常見(jiàn)，見(jiàn)于7例36.84%病人，并且有單克隆性t細(xì)胞出現(xiàn)。其中v1、v3、v4、v9、v11、v18和v20的克隆性t細(xì)胞僅見(jiàn)于d8+細(xì)胞中，而v7的克隆性t細(xì)胞僅見(jiàn)于d4+亞群。此外，在l患者即使多克隆表達(dá)的亞家族t細(xì)胞中，基因掃描圖形峰的分布也明顯異常，見(jiàn)圖4、5。圖1正常人外周血部分d4+和d8+t細(xì)胞克隆性情況略fig.1a

5、partfperipheralbldd4+andd8+tellslnalityinnralindividuals圖2l患者d4+和d8+細(xì)胞中trv24個(gè)亞家族表達(dá)情況略fig.2expressinftrv24subfailiesind4+andd8+ellsfrlpatients圖3l患者外周血d4+和d8+t細(xì)胞的克隆性增殖情況略fig.3peripheralbldd4+andd8+tellslnalityinlpatients圖413例d4+中表達(dá)trv21基因的l患者pr產(chǎn)物的基因掃描分析結(jié)果略fig.4genesanresultsftrv21geneind4+ellsfr13lpat

6、ientsnte:4,9,10,12and15areliglne；5isliglnetrendeny；1isbilne；thethersareplylne.fig.5genesanresultsftrv11geneind8+ellsfr14lpatientsnte:10isnlne；1isliglne；4,8and11areliglnetrendeny；13and14arebilne；thethersareplylne.3討論t細(xì)胞是執(zhí)行免疫功能的主要細(xì)胞，外周血中90%以上的t細(xì)胞為t細(xì)胞，tr基來(lái)由可變區(qū)v、高變區(qū)d、結(jié)合區(qū)j和恒定區(qū)4部分基因片段組成。胸腺內(nèi)t細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中v、d和j區(qū)進(jìn)

7、展完全重排而形成具有功能的tr基因。重排過(guò)程中v、d和j結(jié)合的多樣性和n區(qū)不同數(shù)量核苷酸的隨機(jī)插入形成一個(gè)可變化的區(qū)域vndnj，稱為互補(bǔ)確定區(qū)3pleentaritydeteriningregins3,dr3，使tr鏈序列呈現(xiàn)高度多樣性，不同克隆t細(xì)胞的tr重排時(shí)dr3長(zhǎng)度和堿基序列有所不同，這是tr特異地識(shí)別抗原的區(qū)域，它決定了tr的特異性。已報(bào)道v基因可分為24個(gè)亞家族即v124，利用trv亞家族的特異性引物檢測(cè)dr3的長(zhǎng)度可以作為一種特異的方法用于t細(xì)胞克隆性分析。通過(guò)分析trv的基因譜系和dr3長(zhǎng)度和序列，可以準(zhǔn)確地分析不同trv亞家族t細(xì)胞的基因表達(dá)和克隆性,是目前分析t細(xì)胞克隆性

8、最為敏感的方法3，4。該方法可以很好地對(duì)腫瘤患者外周血t細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)性t細(xì)胞tuurinfiltratinglyphyte,tiltrv亞家族的表達(dá)和克隆性進(jìn)展分析，從而深化理解機(jī)體的免疫功能和對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性免疫反響情況5。正常情況下，機(jī)體未受任何抗原刺激時(shí)，tr重排是隨機(jī)的，其t細(xì)胞表現(xiàn)為多家族和多克隆性，但在疾病情況下，特殊的抗原刺激可引起某一個(gè)或幾個(gè)亞家族的tr針對(duì)性重排，出現(xiàn)克隆性增殖。本研究發(fā)現(xiàn)l患者d4+和d8+細(xì)胞均選擇性表達(dá)121個(gè)v亞家族，提示了l患者trv亞家族優(yōu)勢(shì)利用的特點(diǎn)。假設(shè)與其pbs相比，v亞家族的缺失相對(duì)較輕，這種差異可能由于單位數(shù)量的pbs中t細(xì)胞

9、含量較低，某些表達(dá)量較低的亞家族未能檢測(cè)到，t細(xì)胞純化后檢測(cè)的靈敏度進(jìn)步。而d4+與d8+細(xì)胞中trv亞家族的利用情況無(wú)明顯差異，且均以v13的表達(dá)率最高，說(shuō)明l患者外周免疫缺陷的分布在不同t細(xì)胞亞群無(wú)明顯的傾向性。t細(xì)胞識(shí)別多樣性抗原依賴于tr的多樣性，即多克隆的t細(xì)胞。而在本研究中多數(shù)患者的一些v亞家族出現(xiàn)克隆性增殖的t細(xì)胞，這很可能是在l抗原或其相關(guān)抗原的刺激下產(chǎn)生的具有特異性抗l效應(yīng)的t細(xì)胞克攏因?yàn)樵隗w外利用滅活的腫瘤細(xì)胞或腫瘤相關(guān)抗原多肽等作為特異性抗原誘導(dǎo)正常人t細(xì)胞擴(kuò)增，結(jié)果與腫瘤患者所表現(xiàn)的t細(xì)胞克隆性增殖情況相似，對(duì)原刺激細(xì)胞還具有殺傷活性6。而在體內(nèi)這些克隆性增殖的t細(xì)胞未能顯示出明顯的殺滅白血病細(xì)胞的作用，考慮可能與以下幾方面的因素有關(guān)：患者機(jī)體免疫功能低下，未能產(chǎn)生足夠數(shù)量的具有殺傷活性的t細(xì)胞來(lái)對(duì)抗體內(nèi)大量惡性增殖的腫瘤細(xì)胞，這從本實(shí)驗(yàn)室以往的研究發(fā)現(xiàn)l患者胸腺近期輸出功能低下的結(jié)果可以得到證明1；克隆性增殖的t細(xì)胞功能不成熟，不能分泌殺傷靶細(xì)胞所需要的物質(zhì)如：穿孔素和顆粒酶等；患者體內(nèi)存在抑制這些克隆性t細(xì)胞殺傷活性的因子，使其不能有效發(fā)揮作用；白血病患者內(nèi)環(huán)境紊亂，而體內(nèi)殺傷過(guò)程是依賴溫度、能量以及g2+離子存在的過(guò)程；腫瘤細(xì)胞增殖的速度超過(guò)了t細(xì)胞的殺傷速度等等。總之，tl對(duì)靶細(xì)胞的殺傷是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，目前對(duì)這一過(guò)程以及克隆性增殖的t