1、2022/10/2xxx1聚合酶鏈式反應技術及應用 檢驗醫學院生命科學學院2022/9/28xxx1聚合酶鏈式反應技術及應用 2022/10/2xxx2聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）技術是生命科學界的重大發明，是生物技術領域中最重要的四項生物技術（即細胞融合技術、分子克隆術、蛋白工程技術和基因擴增技術）之一。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內）擴增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達到一個細胞、甚至一個分子的水平。 2022/9/28xxx2聚合

2、酶鏈式反應（polymeras2022/10/2xxx3PCR發展簡史PCR的發明人，一般公認是凱利穆利斯（K. Mullis, 在Cetus公司工作期間，發明了PCR 。1983年4月穆利斯萌發了PCR的構想;1985 關于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 發 表; 1987 當年7月Cetus 公司在美國獲得PCR基本技術專利批準,并于當年11月推出了第一 個PCR試劑產品及第一臺熱循環儀；1989 Science 報道了耐熱性DNA多聚酶 Taq 酶的 發現,預示著分子時代的到來；1990 Cetus科學家 D.Gelfand和S.Stoffel發明

3、了純 化Taq DNA 多聚酶的方法；1991 TaqMan 技 術 發 表；九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開；1998年 實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測。2022/9/28xxx3PCR發展簡史PCR的發明人，一般2022/10/2xxx4引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/9/28xxx4引物引物Mullis的構思DNA聚2022/10/2xxx5Kary B. Mullis 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學發明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。2022/

4、9/28xxx5Kary B. Mullis 2022/10/2xxx6PCR的應用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他2022/9/28xxx6PCR的應用研究2022/10/2xxx7PCR技術的基本原理是DNA的半保留復制，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。在體內，DNA復制是周期性的，所以基因擴增的數量有限；PCR技術在體外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合適的底物和因子，通過對溫度的控制，使DNA不斷位于變性、復

5、性和合成的循環中，達到擴增DNA的目的。 2. PCR基本原理2022/9/28xxx7PCR技術的基本原理是DNA的半保2022/10/2xxx8模板DNA94變性55退火72引物延伸第二次循環模板變性退火延伸圖6-1 PCR原理示意圖2022/9/28xxx8模板DNA94變性55退火722022/10/2xxx91234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/9/28xxx91234522557294時間（m2

6、022/10/2xxx10PCR產物生成曲線擴增產物循環次數指數擴增期擴增平臺期2022/9/28xxx10PCR產物生成曲線擴增產物循環次2022/10/2xxx11PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個 PFU (空斑形成單位)細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，24 小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等組織的粗提DNA2022/9/28xxx11PCR的特點靈敏度高2022/10/2xxx12反應體系： （五要

7、素） 模板（template）引物(primer) 人工合成的兩段寡核苷酸序列，決定RCP的特異性。3. PCR反應體系和反應條件DNA RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因組DNA質粒DNA2022/9/28xxx12反應體系： （五要素）3. PC2022/10/2xxx13PCR反應成功擴增的一個關鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設計。引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率，特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子；引發效率是指在每一PCR循環中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。20

8、22/9/28xxx13PCR反應成功擴增的一個關鍵條件2022/10/2xxx14引物的長度 典型的引物為18-24個核苷酸，在一定范圍內引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性；引物長度的上限主要與反應效率有關，所以一般又不能太長，因為過長會導致其延伸溫度大于72，即Taq酶的最適溫度。引物設計基本原則2022/9/28xxx14引物的長度 典型的2022/10/2xxx15PCR產物長度 一般來說，PCR產物長度對擴增效率有影響。擴增片段長度在普通PCR以200500bp為宜；實時熒光PCR則為50150bp。2022/9/28xxx15PCR產物長度 一般

9、來說，2022/10/2xxx16引物的均衡性和GC含量 引物中堿基組成應盡可能隨機分布，避免出現嘌呤或嘧啶堿基堆積現象。有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高(非特異性擴增)或過低（特異性降低）都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/9/28xxx16引物的均衡性和GC含量 2022/10/2xxx17引物溶解溫度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度. Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/9/28xxx17引物溶解溫度

10、（Tm值） 2022/10/2xxx18引物自身 引物間3端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗; 引物3端的幾個堿基與模板DNA需嚴格配對，并最好為低穩定性結構。 5端序列對PCR影響不如3端大，常用來引進修飾位點或標記物。 2022/9/28xxx18引物自身 2022/10/2xxx19- DNA 聚合酶(DNA polymerase) PCR發明初期，不耐熱的Klenow片段耐熱的Taq DNA聚合酶良好的熱穩定性：92.5、95、97.5時，半衰期分別為130、40、56 min；良好的延伸效率：在7580 時延伸效率最高，每個酶蛋白分子的延伸速度可達150個核苷酸/s；

11、無35外切酶活性，缺乏校正功能；2022/9/28xxx19- DNA 聚合酶(DNA po2022/10/2xxx20dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP- PCR buffer:一般組成：50mM KCl, 10-50mM, Tris-Cl (室溫PH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl：促進引物退火，高濃度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性；Tris-Cl：調節pH值，使反應體系偏堿性；MgCl2 ：調節Taq DNA聚合酶活性、影響引物退火，PCR產物的特異性等2022/9/28xxx20dNTP: 包括dATP、dTT2022/10/2xxx211）PCR反應

12、成分（1）模板一般100ng DNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。 PCR反應條件2022/9/28xxx211）PCR反應成分（1）模板 P2022/10/2xxx22（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus，水生棲熱菌) 0.5-5 U/100 l 酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。2022/9/28xxx22（2）引物濃度2022/10/2xxx23（4）dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應相等 濃度過高易產生錯誤

13、堿基的摻入,濃度過低則降低反應產量 dNTP可與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。2022/9/28xxx23（4）dNTP2022/10/2xxx24（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。對于大多數的PCR引物來說， Mg2+濃度為1.5mmol/L是適宜的，如果擴增效果不好，則調整鎂離子的濃度可能會有所幫助。Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2022/9/28xxx24（5） Mg2+ Mg2+是DN2022/10/2xxx252）循環參數變

14、性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94, 30s1min。(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定，一般比引物Tm值約低5。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性，但特異性低。熱啟動：在第一輪擴增前必須使模版DNA完全變性，一般94，變性5分鐘2022/9/28xxx252）循環參數熱啟動：在第一輪擴增2022/10/2xxx26（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時間由擴增片段長度決定。（13 min)（4）循環次數 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-30次 次數過多：產生“平臺效應” 錯誤摻入率增加2022/9/28xxx26（3）延伸2022/10/2

15、xxx274.PCR擴增產物的檢測方法凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法 、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長度多態性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構型多態性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法 PCR產物測序 熒光PCR2022/9/28xxx274.PCR擴增產物的檢測方法凝膠2022/10/2xxx28(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：DNA在電泳緩沖液中帶負電荷，將PCR產物點樣于負極端的加樣孔，在電場力的作用下DNA涌向正極，并且由于電荷效應和分子篩效應，不同DNA分子量及構型的DNA涌動率不同；在電泳過程中，凝膠中的EB將嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復合物發出

16、橙紅色熒光，熒光強度與DNA含量成正比；不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同。操作簡單，但存在EB污染。2022/9/28xxx28(一)瓊脂糖凝膠電泳法基本原理：2022/10/2xxx29聚丙烯酰胺凝膠電泳特點及用途特點：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱點。用途：PCR擴增指紋圖、多重PCR、PCR產物限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）分析。2022/9/28xxx29聚丙烯酰胺凝膠電泳特點及用途特點2022/10/2xxx3

17、0(二)PCR-限制性片段長度多態性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內切酶可識別特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內切酶對目的DNA分子進行消化，得到的酶切片段其大小和數量可以在一定程度上反應出目的DNA分子的序列信息用途：傳染病病原體基因分型 人類基因的變異性研究。是診斷遺傳病和傳染病病原體基因分型的常用方法2022/9/28xxx30(二)PCR-限制性片段長度多態2022/10/2xxx31PCR-RFLP法： 限制性內切酶

18、惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內切酶2022/9/28xxx31PCR-RFLP法： 限制性2022/10/2xxx32(三) 單鏈構型多態性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，簡稱PCR-SSCP）本法就是將PCR 產物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA （ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，由于DNA 分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結構有關，而空間結構又與ssDNA序列有關。因此，電泳結束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產物序列的差異。2022/9/28xxx32(三) 單鏈

19、構型多態性分析法（P2022/10/2xxx33PCR-SSCP過程 - primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴增 產物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1.為正常 結果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 . 解鏈構像DAN原 理過 程2022/9/28xxx33PCR-SSCP過程 2022/10/2xxx34優點及作用：方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實驗的需要。該方法和其他方法相比有較高的檢測率。首先，它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，

20、另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。不足之處：只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序；電泳條件要求較嚴格；另外，由于SSCP是依據點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現電泳分離的，這樣就可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。2022/9/28xxx34優點及作用：方法簡便、快速、靈敏2022/10/2xxx35(四) 核酸探針雜交法(1)點雜

21、交（dot blot）(2)反向點雜交（reverse dot blot）(3)微孔板夾心雜交（microplate hybridization）(4)熒光探針雜交(5)Southern印跡雜交（Southern blot）2022/9/28xxx35(四) 核酸探針雜交法2022/10/2xxx36樣品正對照負對照標準分子量 污染是PCR實驗的常見問題。只要實驗室里曾經擴增過某個片段，就有可能以后的實驗中發生污染。因此，做實驗的時候絕對不要忘了負對照。用紫外燈破壞污染物也是一個辦法5. PCR常見問題及分析2022/9/28xxx36樣品正對照負對照標準分子量 污染2022/10/2xxx3

22、7(1) 假陽性PCR產物是最主要的污染源。陽性對照的污染。標本之間的交叉污染。在采集標本時，其他污染源帶來的污染。使用帶有污染的試劑。預防措施：2022/9/28xxx37(1) 假陽性預防措施：2022/10/2xxx38(2) 假陰性假陰性是PCR反應中另一個易出現的問題。造成的原因也比較多。可以歸納以下幾方面原因。1)標本處理的原因。 處理標本時，靶DNA丟失。 處理標本時，雜質成分沒有去除干凈，帶入PCR反應中抑制了Taq酶活性。 標本放置不當，模板發生降解（尤其是RNA）。2022/9/28xxx38(2) 假陰性2022/10/2xxx392)PCR試劑問題。 引物設計不合理。

23、Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+濃度過低或是沒有加。3)PCR擴增過程中的問題 PCR擴增儀故障。 PCR擴增反應液沒有加液體石蠟油。 4) PCR產物鑒定中的問題 電泳時沒有加溴化乙錠。 電泳緩沖液和凝膠使用次數過多。 凝膠濃度過低，使擴增帶跑散。2022/9/28xxx392)PCR試劑問題。2022/10/2xxx40(3) 引物二聚體形成引物二聚體的原因有： 兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補區。 引物比例太高，可增加模板用量。 退火溫度過低。 熱循環次數過多。2022/9/28xxx40(3) 引物二聚體2022/10/2xxx41(4) 非特異

24、性PCR產物造成非特異性PCR產物的常見原因及其預防措施： 引物特異性不高或用量太大，應更換引物或降低用量；TaqDNA聚合酶質量不好或用量太大，應更換酶或降低酶使用量； Mg2+濃度過高，可適當調整其濃度；退火溫度過低，可提高退火溫度；延伸時間過長，可減少延伸時間；熱循環次數過多，應適當增加模板量，減少循環次數。2022/9/28xxx41(4) 非特異性PCR產物2022/10/2xxx426. PCR技術的發展巢式PCR（nested PCR ）逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR) 重組PCR(recom

25、binant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對稱PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴增長片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)差示PCR（DD-PCR） 定量PCR 2022/9/28xxx426. PCR技術的發展巢式PCR2022/10/2xxx43圖6-3 巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內引物1內引物2第一次 PCR第二次 PCR（一）巢式PCR （nested PCR ） 2022/9/28xxx4

26、3圖6-3 巢式PCR原理示意圖2022/10/2xxx44提高反應的特異性2022/9/28xxx44提高反應的特異性2022/10/2xxx45RNA 模板逆轉錄酶DNA-RNA 雜化雙鏈RNA酶單鏈cDNA聚合酶雙鏈cDNA（二）逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）2022/9/28xxx45RNA 模板逆轉錄酶DNA-RN2022/10/2xxx46one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉錄酶、逆轉錄引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和緩沖液，直接以mRNA為模板進行逆轉錄和PCR擴增，稱為一步法RT-PCR。Tth

27、DNA聚合酶具有逆轉錄功能和DNA聚合功能。常用的逆轉錄酶有AMV逆轉錄酶（最適溫度為42）和MoMLV逆轉錄酶（最適溫度為37），常用的逆轉錄引物有三種：隨機引物；Oligo（dT），只適合于3端帶有poly(A)尾的mRNA；特異性引物，只適合于逆轉錄目的RNA序列。以逆轉錄產物cDNA為模板，再做PCR。2022/9/28xxx46one-step RT-PCR：2022/10/2xxx47經濟2022/9/28xxx47經濟2022/10/2xxx48（三）多重PCR（multiplex PCR） PCR一般由一對引物擴增產生一個核酸片段，以此手段診斷疾病的效率低。為提高效率，常采用多

28、重PCR技術。該技術是在一個反應體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段，由于每對引物擴增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。2022/9/28xxx48（三）多重PCR（multipl2022/10/2xxx49用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物2022/9/28xxx49用于檢測特定基因序列的存在或缺失2022/10/2xxx50乳頭瘤病毒（）檢驗及分型 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率在女性中僅次于乳腺癌。我國每年有宮頸癌新發病例.萬，占世界宮頸癌新發病例總數的.。臨床科學研究表明，持續感染是

29、導致宮頸癌的直接原因。可分為高危型和低危型兩種，不同的亞型在致癌性方面存在很大的差別。至今發現的病毒約有種，至少有種高危型會構成子宮頸癌。所以提早診斷感染，對尤其是高危型進行檢驗和分型極為重要。 2022/9/28xxx50乳頭瘤病毒（）檢驗及分型 2022/10/2xxx51（四）重組PCR（recombinant PCR）將兩個不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR。該技術主要應用于DNA片段的任何位置引入點突變、插入、缺失以及兩個不相鄰片段的連接。其基本原理是將突變堿基、插入或缺失片段、或一種物質的幾個基因片段的部分堿基設計在引物中，先分段對模板擴增，除去多余的引物后，將產物

30、混合，再用一對引物對其進行PCR擴增。所得到的產物是一重組合的DNA。2022/9/28xxx51（四）重組PCR（recombi2022/10/2xxx52引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，變性和復性延伸異源部分雙鏈DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533（四）重組PCR（recombinant PCR）2022/9/28xxx52引物a引物c引物b引物d532022/10/2xxx53（五）錨定PCR（anchored PCR，APCR） 用于擴增已知一端序列的目的DNA 例如，T細胞受體和免疫球蛋白基因5端具有高度可變性。20

31、22/9/28xxx53（五）錨定PCR（anchore2022/10/2xxx54（六）不對稱PCR（asymmetric PCR）其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50100:1。在PCR最初10-15個循環中，擴增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個循環以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導的PCR就會產生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的要求。2022/9/28xxx54（六）不對稱PCR（asymme2022/10/2xxx5

32、5已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切點（X）限制酶切點（X）限制酶X酶切連接未知序列（七）反向PCR（inverse PCR）2022/9/28xxx55已知序列PCR用途：限制酶切點（2022/10/2xxx56（八）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）以參照物為標準，對PCR終產物進行分析或對PCR過程進行監測，從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數期進行的。 定量PCR定量的理論依據：理想的擴增結 果：Y=X2n 其中Y代表擴增產物量， X代表PCR反應體中的原始

33、模板數 n為擴增次數； 理 論上PCR擴增效率為 100%，PCR產物隨著循環的進行成指數增長，但實際上：DNA的每一 次復制都不完全，即每一次擴增中，模板不是呈 2 的倍增長；實際應為：Y= X(1+E)n ，其 中E 代表擴增效率：E = 參與復制的模板/總模板，通常E1，E在整個PCR擴增過程中不是 固定不變的。通常X 在 1105 拷貝、循環次數n30 時，E 相對穩定，原始模板以相對固 定的指數形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數期；2022/9/28xxx56（八）定量PCR（Quantit2022/10/2xxx571PCR定量DNA 一個或兩個拷貝的特定靶序列的細胞株即是

34、標準的一個理想來源，也可使用含特定靶序列的質粒DNA作為對照，將待檢樣品與一系列稀釋的標準對照一起擴增，檢測PCR產物，即可推知靶序列的含量。2PCR定量mRNA (1)mRNA相對定量靶基因的擴增產物量與內源性對照的擴增產物量的比值 (2)競爭性PCR定量mRNA (3)cRNA標準曲線法定量mRNA2022/9/28xxx572022/10/2xxx58實時熒光定量PCR（RT-FQ-PCR）與普通PCR的區別 在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準

35、確定量，無法對擴增反應實時檢測普通PCR實時熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測實時熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模

36、板進行定量分析對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測普通PCR實時熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測與普通PCR的區別普通PCR實時熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測

37、2022/9/28xxx58實時熒光定量PCR（RT-FQ-2022/10/2xxx59如何對初始模板定量?熒光信號如何產生？Real time PCR 實時監測系統2022/9/28xxx59Real time PCR 實時2022/10/2xxx60實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析2022/9/28xxx60實時熒光定量PCR原理定量原理介2022/10/2xxx61實時熒光定量PCR 原理 - 擴增曲線擴增曲線圖： 橫坐標：擴增循環數（Cycle）；縱坐標：熒光強度 每個循環進行一次熒光

38、信號的收集熒光基團熒光檢測元件2022/9/28xxx61實時熒光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx62實時熒光定量PCR 原理 -熒光閾值熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個循環信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設置是315個循環的熒光信號的標準偏差的10倍 手動 設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的最初階段，并且保證回歸系數大于0.99 真正的信號:熒光信號超過域值2022/9/28xxx62實時熒光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx63實時熒光定量P

39、CR 原理 -Ct值Ct值的定義： PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數C(t) value 2022/9/28xxx63實時熒光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx64實時熒光定量PCR 原理 -Ct值的重現性橫軸：PCR反映循環數縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定； Ct值則極具重現性2022/9/28xxx64實時熒光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx65熒光定量PCR原理理想的PCR反應：X=X0*2n非理想的PCR反應：X=X0 (1+Ex)nn：擴增反應的循環次數X：第n次循環后的產物量X0

40、：初始模板量Ex：擴增效率XCt=X0 (1+Ex)Ct =Nlog X0= - log(1+Ex) *Ct+ log NXCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量. 在閾值線設定以后,它是一個常數最后結論：Log X0與Ct呈線性關系，根據樣品擴增的Ct值就可計算出樣品中所含的模板量2022/9/28xxx65熒光定量PCR原理理想的PCR反2022/10/2xxx66 標準曲線（使用外參照物的定量PCR） 將已知濃度的標準品梯度稀釋進行Real time PCR，就會按照起始DNA濃度由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。再由Ct值與起始模版的對數值之間存在的線性關系，就可制作標準曲

41、線。未知濃度的樣品與標品一樣，也可得到Ct值，并將Ct值代入標準曲線，就可以求出未知濃度樣品的起始模版量。 2022/9/28xxx66 標準曲線（使用外參照2022/10/2xxx67熒光信號如何產生？非特異性熒光標記：1、SYBR Green 特異性熒光標記：2、TaqMan3、Molecular Beacon2022/9/28xxx67熒光信號如何產生？非特異性熒光標2022/10/2xxx68 SYBR Green ISYBR Green 只有和雙鏈DNA結合后才發熒光（ SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位）變性時，DNA雙鏈分開，無熒光在延伸結束階段采集熒光信號。S

42、YBR Green 也能和非特異的雙鏈DNA結合發光，所以必須在反應結束時做熔解曲線分析2022/9/28xxx68 SYBR Green IS2022/10/2xxx69SYBR-Green I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission雙鏈熒光染料 SYBR-Green I熒光染料原理示意圖2022/9/28xxx69SYBR-Green I532022/10/2xxx70SYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission2022/9/28xxx70SYBR-Green I532022/10/2xxx71Real-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2Molecular Probe公司的一個專利產品，US Patent5,436,134 1993年7月12日申請2022/9/28xxx71Real-Time PCR，SY2022/10/2xxx72熒光強度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI游離Tm是熔解曲線的特征值：SYBR Green I 熔解曲線分析當雙鏈DNA解鏈一半時，熒光信號強度急劇下降，此時的