1、復原型谷胱甘肽對大鼠呼吸機相關性肺損傷的保護作用【摘要】目的研究復原型谷胱甘肽(GSH)對大鼠呼吸機相關性肺損傷(VILI)的保護作用。方法24只安康雄性SD大鼠隨機分為3組(每組n=8),A組為自主呼吸組;B組為大潮氣量機械通氣組;組為大潮氣量機械通氣加GSH處理組。B、2組呼吸參數：潮氣量(VT)=30l/kg、頻率(P)為40次/in、通氣時間為4h。每小時行1次動脈血氣分析,計算氧合指數(Pa2/Fi2)。實驗完畢搜集肺組織和肺灌洗液標本。光鏡觀察肺組織病理形態改變,免疫組化檢測Fas/FasL蛋白,檢測肺濕/干重比(/D)、肺組織丙二醛(DA)、超氧化物歧化酶(SD)、肺灌洗液中白細

2、胞計數、腫瘤壞死因子(TNF-)和蛋白總量。結果和A組比擬，B組肺組織病理學改變明顯,Fas/FasL蛋白增加,/D、白細胞計數(B)、TNF-、DA等指標升高，而SD及通氣3h以后Pa2/Fi2下降;和B組比擬,組肺組織病理學改變明顯減輕,Fas/FasL蛋白質量減少,/D、B、TNF-、DA等指標降低，SD、Pa2/Fi2上升。結論GSH對VILI有一定的保護作用?！娟P鍵詞】呼吸機相關性肺損傷;機械通氣;復原型谷胱甘肽Abstrat：bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetsfreduedglutathinenventilatr-induedlunginjur

3、y(VILI)inrats.ethds24aleSprague-Daleyratsererandlydividedint3grups(n=8eah):grupAreEivedrairithutehanialventilatin;grupBreEIvedehanialventilatinflargetidalvlue(VT)ithrair;grupastreatedithehanialventilatinflargetidalvlueithrairplusreduedglutathine.ThesetparaetersfehanialventilatiningrupsBand:VT=30l/kg

4、,breathingrate=40ties/in,andtiefventilatin=4h.Arterialbldgasesereeasuredhurlytalulatexygenatinindex(Pa2/Fi2).Ratseresarifiedandthelunglavageliquidandlungtissueerelletedandstredithrretethds.Theeasuredindexesinludingttalprtein,BsandTNF-inbrnhalvelarlavagefluid(BALF),et-t-dryeightrati(/D)flung,alndiald

5、ehyde(DA)andsuperxidedisutase(SD)levelsinthelungereassayed,respetively.LungpathlgialhangesandtheexpressinsfFas/FasLprteinserebservedbyirspy.ResultsparedithgrupA,ttalprtein,/D,Bs,TNF-,DAandtheexpressinfFas/FasLprteinssignifiantlyinreasedingrupB,hilethelevelsfSD,andPa2/Fi2at3hafterventilatinsignifiant

6、lydereased.paredithgrupB,ttalprtein,/D,Bs,TNF-,DAandexpressinsfFas/FasLprteinsdereasedingrup,andthelevelsfSDandPa2/Fi2inreased.nlusinReduedglutathinehasertainprtetiveeffetnventilatr-induedlunginjury.Keyrds:ventilatr-induedlunginjury;ehanialventilatin;reduedglutathine呼吸機相關性肺損傷(ventilatr-induedlunginj

7、ury,VILI)是肺功能嚴重受損的患者行機械通氣支持治療時的常見并發癥;其發生率高達15%。而且長時間使用會增加急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(DS)的發生率。VILI本質上是一種生物傷1，近些年來成為研究的熱點。其致病機制之一可能是由于過度的機械刺激引起肺細胞內氧化應激，導致氧化-抗氧化系統失衡，從而激活多種和炎癥親密相關的信號轉導通路,使各種致炎因子的表達增多,引起炎性細胞在肺組織“募集,從而造成肺損傷。因此，抗氧化劑可能對各類急性肺損傷有一定的保護作用。復原型谷胱甘肽(GSH)2是機體內重要的抗氧化劑，可以通過P38和JNK信號通路抑制促炎因子和去除機體內氧化物質

8、。有研究說明GSH能明顯減輕大鼠內毒素誘導的急性肺損傷3。本實驗利用大鼠VILI為模型，研究GSH對大鼠VILI的保護作用。1材料和方法1.1實驗動物及動物準備安康雄性清潔級SD大鼠(徐州醫學院實驗動物中心提供)24只，體重(30020)g。10%水合氯醛(300g/kg)腹腔內注射麻醉后,氣管切開及插入自制氣管導管;行尾靜脈穿刺保持靜脈通道;行右頸內動脈置管，以4U/(lh)速度輸注肝素維持動脈通暢，每小時行1次血氣分析，每次取血后從尾靜脈補充注入等容量的膠體液以維持近似恒定的血容量;體溫維持在3738。1.2實驗分組及動物模型24只大鼠隨機分為3組,每組8只。自主呼吸組(A組);大潮氣量機

9、械通氣組(B組),維庫溴銨1g/(lh)靜脈輸注抑制自主呼吸、維持肌松,接小動物呼吸機(浙江大學醫學儀器廠,DH-150型)開場機械通氣。呼吸參數設定：呼吸頻率40次/in,通氣時間4h，吸呼比(IE)=13，呼氣末正壓通氣(PEEP)=0，潮氣量(VT)=30l/kg;根據體重調節VT;大潮氣量機械通氣加GSH處理組(組)，機械通氣開場前30in從尾靜脈注射GSH90g/kg，A、B2組給予等量的生理鹽水，呼吸參數同B組。大鼠大潮氣量損傷性機械通氣的動物模型是參考武慶平等4的相關實驗研究并稍作修改制備的。1.3標本采集通氣4h后,頸動脈放血處死大鼠。開胸取出肺臟,取1小塊右上葉肺組織用作病理

10、學檢查及免疫組化檢測,取右中葉肺稱重;剩余右肺制成肺組織勻漿液:按每100g肺組織參加0.9lPBS(pH7.4),在冰浴下用組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿。左肺用4生理鹽水行支氣管肺泡灌洗,每次灌洗量為2l,共灌洗3次,回收率大于90%，搜集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺勻漿液分別于4，3000r/in離心15in,取上清-70凍存;BALF離心后沉淀，用1l生理鹽水稀釋行白細胞計數。1.4檢測指標及方法1.4.2BALF中總蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法,用UV-2401型分光光度計測量光密度。1.4.3肺濕/干重比值(/D)取右中葉肺組織稱濕重后置于烤箱中,70烘烤至恒重后稱干重,計算

11、肺/D比值。1.4.4BALF中TNF-含量試劑盒由深圳晶美生物工程提供。采用雙抗體夾心ELISA法，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進展。先在酶標儀上測量標準品光密度并繪制出標準曲線,然后測量樣品光密度,并根據測得的光密度在標準曲線上讀出樣品的濃度(ng/L)。1.4.5肺組織Fas/FasL蛋白表達試劑盒由武漢博士德公司提供。肺組織經石蠟包埋切片免疫組化采用SAB法，DAB顯色，實驗步驟按試劑盒說明進展。采用IagePr-plus6.0細胞圖像分析儀分析圖像。在顯微鏡(400)下以一樣外部條件(亮度)每張切片選擇10個視野，設定灰度值50250，計算平均灰度值。1.4.6肺組織SD和DA含量試

12、劑盒由南京建成生物工程研究所提供。分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進展。用UV-2401型分光光度計測量光密度。1.4.7氧合指數(Pa2/Fi2)是指動脈血氧分壓與吸入氧氣濃度的比值，正常值應大于300，是反映換氣功能較直接的指標,可動態反映患者的換氣功能。1.5統計學處理實驗數據用s表示,應用SPSS13.0軟件對數據進展單因素方差分析，兩兩比擬采用q檢驗,P0.05認為差異有顯著性。2結果A.A組;B.B組;.組2.2Pa2/Fi2肺/D、DA、SD、BALF中總蛋白量、B和TNF-含量的變化和A組比擬,B組通氣3h以后Pa2/Fi2均下降(P0.05

13、)，肺/D、DA、BALF總蛋白量、白細胞計數和TNF-等各項指標均增高(P0.05),SD下降(P0.05);組通氣3h以后Pa2/Fi2高于B組(P0.05)，肺/D、DA、BALF中總蛋白、白細胞計數和TNF-等各項指標均低于B組(P0.05),SD高于B組(P0.05)。見表1、2。表1各組大鼠不同時間點Pa2/Fi2的變化與A組比擬:*P0.05;與B組比擬:P0.05表2各組大鼠BALF中總蛋白含量、B、TNF-，肺/D和肺組織DA、SD的比擬與A組比擬:*P0.05;與B組比擬:P0.052.3肺組織Fas/FasL蛋白的表達2種蛋白表達陽性反響物質呈棕黃色,主要位于細胞質中;陽

14、性表達細胞為支氣管黏膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、炎性細胞(圖2、3);免疫組化半定量結果:B組Fas/FasL蛋白表達明顯高于A組(P0.05),組那么低于B組(P0.05)。見表3。圖2SP法檢測3組Fas蛋白表達(DAB染色，400)表3各組大鼠Fas、FasL蛋白的表達轉貼于論文聯盟.ll.3討論在急性肺損傷/ARDS患者治療過程中常需要機械通氣,然而機械通氣也是導致急性肺損傷發病的機制之一，其致病機制非常復雜，包括氧化-抗氧化失衡在內的眾多機制都會增加VILI的敏感性。hess等5和Haershidt等6研究機械通氣可以加重肺的氧化應激反響，產生多種氧化物質。一系列研究說明2，7-9氧化

15、應激狀態下的肺組織細胞內氧化-抗氧化失衡如GSH氧化復原系統，GSH氧化型增加而復原型減少，可以通過P38和JNK信號通路釋放出大量促炎因子和氧化物質，抗氧化物質減少;使機體去除氧化物質(如H22)才能減弱，產生細胞毒性，從而加重肺組織細胞損傷。同時,炎癥因子能募集中性粒細胞進入肺泡腔,分泌蛋白酶類和大量活性氧類,釋放炎癥介質,造成肺泡毛細血管屏障的通透性增加,導致肺內炎癥反響,進一步加重組織細胞損害1。盡管已經研究出許多不同的通氣策略降低VILI的發生率,但它仍然是嚴重呼吸衰竭治療過程中的一個重大問題。近年來,越來越多的研究致力于探究新的藥物治療生物傷方法。GSH是人體內重要的抗氧化劑之一，

16、是GSH氧化復原系統的組成部分，GSH有氧化型和復原型2種形式,可以互變11。該系統具有對抗氧自由基、保護肺組織免受氧化損傷的作用,被稱為組織抗氧化系統。劉慶輝等12研究說明使用GSH前體N-乙酰半胱甘酸對VILI有保護作用。Hartl等13研究說明氣道吸入GSH對肺的纖維化有保護作用。大鼠大潮氣量機械通氣致肺損傷實驗模型，是模擬臨床上急性肺損傷/ARDS患者需要大潮氣量通氣治療以及此類患者可能會發生嬰兒肺13，即使采用小潮氣量通氣，但由于部分肺不張等原因在肺其他正常部位也會產生像大潮氣量通氣引起的肺損傷。Fas/FasL蛋白表達、肺/D、Pa2/Fi2、BALF總蛋白可反映肺受損以及肺水腫的

17、程度;B、TNF-可反映白細胞的浸潤以及炎癥反響的程度;DA是一種脂質過氧化產物,是檢測體內脂質過氧化程度的客觀指標。SD在體內能去除生物氧化產生的自由基而對細胞起保護作用。本實驗結果說明，B組大潮氣量機械通氣產生了明顯的肺損傷,機體抗氧化應激才能下降,同時Fas/FasL參與了肺損傷過程。和B組相比,組大鼠抗氧化才能增強，Fas/FasL表達下降,機械通氣所致的肺損傷有所減輕，但重于A組。說明GSH可以增強機體抗氧化才能，抑制組織脂質過氧化的發生,減少Fas/FasL系統介導的凋亡，減輕組織水腫及中性粒細胞的聚集，對肺組織有一定的保護作用。其可能的作用機制:急性肺損傷時氧化應激增強,GSH在

18、血中、肺泡上皮襯液及肺部其他細胞中含量降低3，14。靜脈使用GSH增加肺細胞內外GSH含量，去除氧化產物，可能通過抑制P38和JNK通路抑制炎癥遞質的釋放，減輕炎癥反響;同時可能通過影響Fas/FasL抑制凋亡，減少肺和毛細血管的損傷。上述結果說明GSH對大鼠VILI具有一定的保護作用,其作用機制可能與氧化、凋亡有關。但本實驗沒有觀察VILI大鼠遠期存活率及其作用的詳細相關信號通路，仍需要進一步深化研究。【參考文獻】1HalbertsaFJ,Vaneker,ShefferGJ,etal.ytkinesandbitrauainventilatr-induedlunginjury:aritialr

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