1、蜂膠體外誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡的實驗研究【摘要】目的討論蜂膠對喉癌細(xì)胞珠ep-2凋亡的影響及作用機制。方法用流式細(xì)胞儀、原位末端標(biāo)記法、激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)，觀察蜂膠對細(xì)胞的抑制、凋亡情況及細(xì)胞內(nèi)a2+變化。結(jié)果蜂膠能抑制Hep-2細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡，非特異性地阻滯Hep-2細(xì)胞周期的全過程。原位末端標(biāo)記檢測出細(xì)胞凋亡率亦有時間、劑量依賴性。細(xì)胞內(nèi)a2+隨蜂膠濃度的增加而升高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論蜂膠可以抑制喉癌細(xì)胞生長，其抑制作用是通過誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡而起作用的。【關(guān)鍵詞】蜂膠；Hep-2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡目前，喉癌的治療是以手術(shù)為主的綜合治療，化療是其中重要的組成局部，用于喉癌的化療藥

2、物尚缺乏理想的選擇性。蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽及樹木的枝條上采集樹脂類物質(zhì)，與其唾液混合加工成一種芳香性膠狀固體物，含有多種黃酮、槲皮素、肉桂酸衍生物、多糖、氨基酸等有藥理活性的化合物1。它不僅具有抗病原微生物、抗氧化、抗炎、護肝等作用，還具有抗腫瘤作用。為進一步討論其抗癌作用機理，我們觀察了蜂膠對喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的影響。現(xiàn)報道如下。1材料1.1蜂膠提取物取本地產(chǎn)蜂膠，冰凍粉碎后以95%乙醇浸泡72h，過濾，濾液于40減壓揮干溶劑，二甲基亞砜DS溶解定容為2g/l。1.2試劑及儀器RPI1640培養(yǎng)液為美國GIB公司產(chǎn)品；FASalibur流式細(xì)胞儀為美國BETNDIKINSN公司產(chǎn)品；P

3、D試劑盒購自華美生物工程公司；R-1024激光共聚焦顯微鏡BI-RAD公司產(chǎn)品。1.3細(xì)胞株人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞株由白求恩國際和平醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科實驗室惠贈。2方法2.1蜂膠濃度分組實驗前用RPI1640(Gib公司)將蜂膠提取物稀釋成20，40，80，160g/l，DS的濃度低于0.02%。2.2流式細(xì)胞儀檢測搜集對照組和80g/l蜂膠作用不同時間(24，48，72h)的細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，經(jīng)檸檬酸緩沖液固定1h以上，上機前加1800l胰酶消化液充分作用，參加1500l碘化丙啶(PI)作用15in以上，過濾，上機進展細(xì)胞凋亡分析和細(xì)胞周期分析。2.3原位末端標(biāo)記法(TUNEL)

4、定量檢測分別于各劑量藥物作用后24，48，72h搜集細(xì)胞，PBS洗2次，細(xì)胞涂片，室溫枯燥。按原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明進展操作，用普通光鏡計算凋亡率(AI)。計算方法：隨機選取5個高倍視野，分別計陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，代入下式：AI=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%。2.4Hep-2細(xì)胞內(nèi)a2+變化的激光共聚焦顯微鏡檢測對數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞，用D-Hanks液洗滌2次，于37避光條件下Flu-3/A10l/L荷載。40in后用D-Hanks液洗滌細(xì)胞3次，洗去細(xì)胞外剩余染料，最后保存少許細(xì)胞外D-Hanks緩沖液，平衡10in。經(jīng)不同濃度蜂膠作用不同時間，在激光共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強

5、度，激發(fā)波長488n，發(fā)射波長526n，以本底熒光強度為參照0，檢測細(xì)胞內(nèi)a2+熒光強度。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進展統(tǒng)計處理，計量資料用s表示，比擬時采用t檢驗。=0.050。3結(jié)果3.1流式細(xì)胞儀檢查結(jié)果80g/l蜂膠對Hep-2細(xì)胞凋亡率的影響：24，48，72h時Hep-2細(xì)胞抑制率分別為36.2%，44.5%，58.6%，時間越長細(xì)胞凋亡率越高P0.05。24，48，72h時G0/G1期細(xì)胞分別占67.2%，55.8%，59.4%；S期分別占19.1%，28.3%，33.5%；G2/期分別占13.7%，15.9%，7.1%。3.2TUNEL標(biāo)記各組細(xì)胞凋亡率明

6、顯升高，與同時間對照組比擬差異有顯著性，且呈現(xiàn)一定的時間、劑量依賴性。見表1。表1不同濃度、不同時間蜂膠作用的Hep-2的細(xì)胞凋亡率比擬略與對照組比擬，*P0.05，*P0.01，各時間組、各劑量組相關(guān)系數(shù)r經(jīng)檢驗，P0.013.3Hep-2細(xì)胞內(nèi)a2+的變化結(jié)果見表2。隨藥物濃度的增加，不同濃度組之間的細(xì)胞內(nèi)a2+熒光強度亦增高。P0.05。表2兩組不同時點Hep-2細(xì)胞內(nèi)a2+熒光強度比擬略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.4討論蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽及樹干上采集的樹脂，并混入其上腭腺分泌物、蜂蠟和少量的花粉加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。目前，蜂膠中所含抗癌有效成分有：黃酮類、萜烯類、多糖物

7、質(zhì)、酯類化合物等及其他化合物的天然組合，它們之間互相協(xié)調(diào)作用，賦予了蜂膠的抗癌作用1。實驗說明，蜂膠可抑制由化學(xué)致癌物誘發(fā)的基因突變2。由于放療、化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會損傷機體的免疫活性細(xì)胞及造血細(xì)胞，因此，強化機體免疫、對抗放療、化療引起的副作用，是當(dāng)今腫瘤防治工作重要任務(wù)之一。大量研究說明，蜂膠是一種天然的免疫強化劑，同時又兼有抗腫瘤、抗病毒、抗菌的活性3。本實驗說明蜂膠對Hep-2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，且對細(xì)胞周期有一定的影響，既可影響細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變，又可影響S期向G2期的轉(zhuǎn)變過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，非特異性阻滯細(xì)胞周期的全過程。在此根底上，

8、用TUNEL法定量觀察蜂膠誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡的規(guī)律。Hep-2細(xì)胞有一定的自然凋亡率，但蜂膠組中的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組，且具有時間、劑量的依賴性。隨著蜂膠濃度的增加，對癌細(xì)胞的殺傷作用也在增強。a2+信號傳導(dǎo)在細(xì)胞凋亡機制研究中的作用日益受到人們重視。大多數(shù)細(xì)胞在凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)a2+均有所增加46。本實驗結(jié)果顯示，蜂膠作用后Hep-2細(xì)胞內(nèi)a2+相對熒光強度明顯高于對照組，且隨著藥物濃度的增高，a2+熒光強度亦增高。提示a2+的變化在蜂膠誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡中起重要作用，可能系其誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵機制之一。本實驗提醒，蜂膠可以抑制喉癌細(xì)胞的生長，其抑制作用是通過凋亡機制起作用的。【參考文獻】1郭芳彬.蜂膠的抗癌作用J.蜜蜂雜志，2022，91：10.2王菊香，裴士庚，門金娥，等.蜂膠乙醇提取物基因抗突變作用的研究J.癌變畸變突變，2022,171:39.3郭芳彬.蜂膠的抗菌作用J.蜜蜂雜志，2022，103：10.4hiYH，LeeY，NaSY，etalAptsisinduedbyprplisinhuanhepatelluararinaelllineJ.IntJled,1999,4:29.5GinnisK，angKK，GnegyE.Alteratinsfextraellularaliueliitseletivedes