1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)劉小紅電話Q：350783409Email: 350783409生命科學(xué)學(xué)科院 生物技術(shù)教研室實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)一、顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞凝集現(xiàn)象的觀察實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞膜的滲透性實(shí)驗(yàn)四、葉綠體的分離及熒光現(xiàn)象的觀察實(shí)驗(yàn)五、線粒體的分離及觀察實(shí)驗(yàn)六、DNA的Fulgen染色法實(shí)驗(yàn)七、植物細(xì)胞骨架的觀察實(shí)驗(yàn)八、RNA的Brachet反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)九、植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的構(gòu)造原理及使用方法一、普通光學(xué)顯微鏡二、常見(jiàn)特殊顯微鏡三、電子顯微鏡一、普通光學(xué)顯微鏡Ordinary optical microscope（一）基本構(gòu)造（二）放大原理及光路圖（三

2、）性能和質(zhì)量（四）使用方法（五）使用注意事項(xiàng)1、機(jī)械部分（1）鏡座（2）鏡柱（3）鏡臂（4）鏡筒（5）轉(zhuǎn)換器（6）載物臺(tái)（7）調(diào)節(jié)器2、照明部分（1）反光鏡（2）聚光器（3）光圈 3、光學(xué)部分（1）目鏡（5，10， 15）（2）物鏡（ 低：10或 15；高：40或 45；油 ：100）（一）基本構(gòu)造普通顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖（左：?jiǎn)文?；右：雙目）1、 目鏡； 2、鏡筒；3、物鏡轉(zhuǎn)換器；4、物鏡；5、通光孔；6、聚光器；7、光圈；8、反光鏡；9、粗調(diào)節(jié)器；10；細(xì)調(diào)節(jié)器；11、鏡臂；12、移片器；13、載物臺(tái)；14、傾斜關(guān)節(jié)；15、鏡柱；16、鏡座；17、 標(biāo)本移動(dòng)器螺旋；18、燈室 細(xì)胞中期圖片左

3、：低倍鏡；右：高倍鏡（二）放大原理及光路圖透鏡的焦距透鏡的角孔徑2、放大率（magnification)指最終成像的大小與原物體大小的比值?？偡糯舐?= 物鏡放大倍數(shù) 目鏡放大倍數(shù)空氣介質(zhì)：可達(dá)1000倍油介質(zhì)（通常是香柏油）：可達(dá)1400倍分辨本領(lǐng)光源透鏡是否需真空光學(xué)顯微鏡300 nm可見(jiàn)光玻璃透鏡否200 nm (油）可見(jiàn)光玻璃透鏡否100 nm紫外光石英透鏡否電子顯微鏡0.1 nm電子束電磁透鏡是電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別（五）使用注意事項(xiàng)1、持鏡時(shí)必須是右手握臂、左手托座的姿勢(shì)，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其它地方。 2、輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的邊緣，應(yīng)放在距

4、邊緣10cm處，以免碰翻落地。3、觀察有液體的臨時(shí)標(biāo)本時(shí)要加蓋片，以免液體污染鏡頭和顯微鏡。4、粗、細(xì)調(diào)節(jié)鈕要配合使用，不能過(guò)度調(diào)節(jié)，調(diào)時(shí)側(cè)面注視鏡筒下降，以免壓壞標(biāo)本和鏡頭。5、保持顯微鏡的清潔，光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機(jī)械部分用布擦拭。6、水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺(tái)，如果沾污應(yīng)立即用擦鏡紙擦凈。7、放置玻片標(biāo)本時(shí)要對(duì)準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。8、要養(yǎng)成兩眼同時(shí)睜開(kāi)觀察的習(xí)慣，以左眼觀察視野，右眼用以繪圖。9、不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要任意拆卸各種零件，以防損壞。10、使用完畢后，必須復(fù)原才能放回鏡箱內(nèi)，

5、其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)器使鏡頭離開(kāi)通光孔，下降鏡臺(tái)，平放反光鏡，下降集光器(但不要接觸反光鏡)、關(guān)閉光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實(shí)驗(yàn)臺(tái)柜內(nèi)。最后填寫使用登記表。(注：反光鏡通常應(yīng)垂直放，但有時(shí)因集光器沒(méi)提至應(yīng)有高度，鏡臺(tái)下降時(shí)會(huì)碰壞光圈，所以這里改為平放) 二、常見(jiàn)特殊顯微鏡（一）暗視野顯微鏡（二）相差顯微鏡（三）熒光顯微鏡（四）倒置顯微鏡（五）激光共聚焦掃描顯微境1、原理 根據(jù)光學(xué)上的丁道爾（Tyndoll）現(xiàn)象，微塵細(xì)粒在強(qiáng)光直射通過(guò)的情況下，不能為人眼所見(jiàn)，這是因?yàn)楣饩€過(guò)強(qiáng)及繞射現(xiàn)象等因素，因而看不到微塵的形象。若把光線斜射它們，則由于光的反射或衍射的結(jié)果，微塵細(xì)粒似乎

6、增大了體積，而為人眼可見(jiàn)。 據(jù)此原理，使光不直接通過(guò)樣品而是斜射到樣品上，即可在暗視野下觀察細(xì)微粒子。2、構(gòu)造及光路 光源的中央光束被阻擋，不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而光線改變途徑，傾斜地照在標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射、衍射或散射，散射和衍射光線進(jìn)入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。在暗視野中，觀察到的是被檢物體的衍射光和散射光的圖像，并非物體的本身，所以只能看見(jiàn)物體的存在、運(yùn)動(dòng)及外部形態(tài)，不能分辨其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。3、應(yīng)用及使用注意事項(xiàng) 能觀察到0.20.004 m的亞微顆粒，適合觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。 暗場(chǎng)鏡檢要求載玻片和蓋玻片必須無(wú)疵痕而無(wú)塵土，物鏡前透鏡也

7、必須清潔無(wú)塵。 載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)，載玻片太厚，則聚光聚的焦點(diǎn)落在載玻片內(nèi)，而達(dá)不到被檢物體的平面上，蓋玻片太厚，在使用油鏡頭的情況下，由于物鏡的工作距離很短，甚至無(wú)法調(diào)焦，而看不到或看不清被檢物體。水稻花的暗視野顯微鏡圖片（二）相差顯微鏡Phase contrast microscope1、原理 由于細(xì)胞不同部位的折射率不同，當(dāng)光通過(guò)細(xì)胞的不同部位時(shí)有不同程度的滯后，這樣就產(chǎn)生了相位差。 另外一束光通過(guò)物體同一部位后形成兩束光，一束直行形成直射光，另一束斜行或繞行形成衍射光，衍射光的相位相對(duì)落后。當(dāng)二者相遇時(shí)又發(fā)生干涉，合光振幅取決于兩者的相位。 相差顯微鏡就是利用光的衍射和干涉

8、特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對(duì)比，使肉眼得以觀察到無(wú)色透明物體中的細(xì)節(jié)。2、優(yōu)點(diǎn) 能將直射光（視野中的背景光）與經(jīng)物體衍射的光分開(kāi)；能將大約一半的波長(zhǎng)從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)度的變化。加上利用了光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對(duì)比，所以能觀察無(wú)色、透明、活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡下的紅細(xì)胞1、原理 人眼不可見(jiàn)的一定波長(zhǎng)的紫外線作光源照射被檢物體，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大來(lái)進(jìn)行鏡檢。 熒光顯微術(shù)是生物，醫(yī)學(xué)中的重要研究手段，如對(duì)生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等諸方面的鑒定等。熒光顯微

9、鏡的光通路2、基本構(gòu)造 由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件（如熒光光源、激發(fā)濾片、阻斷濾片等）的基礎(chǔ)上組成的。 每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)熒光。 熒光具有專一性，一般比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷（或壓制）濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。293、特點(diǎn)（1）光源為紫外線，波長(zhǎng)較短；（2）分辨力高于普通顯微鏡；（3）有兩個(gè)特殊的濾光片；（4）照明方式通常為落射式。4、分類 據(jù)其光路來(lái)分有兩種：（1）透射式熒光顯微鏡（2）落射式熒光顯微鏡Fluoresce

10、nce image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green熒光顯微鏡下的動(dòng)物上皮細(xì)胞5、使用方法 1打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。 2透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的插塊。3用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。 4放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)

11、，必須用無(wú)熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。（四）倒置顯微鏡Inverted microscope 組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。優(yōu) 點(diǎn) 集光器和載物臺(tái)間的工作距離提高后，可放置培養(yǎng)、培養(yǎng)瓶等容器，直接對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。38（五）激光共聚焦掃描顯微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM)種類波長(zhǎng)氬氟激光（紫外光）193氪氟激光（紫外光）248氙氯激光（紫外光）308氮激光（紫外光）337氬激光（藍(lán)光

12、）488氬激光（綠光）514氦氖激光（綠光）543氦氖激光（紅光）633激光種類及波長(zhǎng)40 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。優(yōu) 點(diǎn)41LCSM Image of a Xenopus Melanophore （爪蟾黑色素細(xì)胞 ）microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)電子顯微鏡Electron microscope（一）透射電子顯微鏡（二）掃描電子顯微鏡（三）掃描透射電子顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原

13、理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場(chǎng)作透鏡；而后者以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。特點(diǎn)45不同光線的波長(zhǎng)47（一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM48 以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2m、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu)， 又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）。1. 原理492. 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡（透射鏡）的結(jié)構(gòu)照相系統(tǒng)電子槍電 磁 透 鏡50 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖 51（二） 掃描電子顯微鏡Scanning electron microscope, STEM掃描電子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)531. 工作原理： 是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由