1、超氧化物歧化酶活性測定第1頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三一、意義：細胞內自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會傷害細胞。植物正常情況下植物逆境脅迫下O-.2、H2O2、OH的產(chǎn)量增加；SOD、CAT、POD活性降低；VtE、VtC、CAR、GSH含量降低；從而傷害細胞。植物體內活性氧代謝系統(tǒng)的平衡被打破第2頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三什么叫逆境？逆境是指對植物生存生長不利的各種環(huán)境因素的總稱. 逆境的種類?第3頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三為什么要測定完全液和缺素苗的SOD活性？第4頁，共1

2、8頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三二、目的要求：1.了解SOD活力測定的實踐意義；2.掌握SOD測定的原理及操作要點；3.比較完全液溶液和缺素溶液培養(yǎng)的 玉米苗葉片SOD活性的差異。第5頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三三、原理：第6頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三三、原理： 依據(jù)SOD能抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2.-，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2.-，從而抑制了甲腙

3、的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。第7頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三四、儀器設備研缽；玻璃試管; 40W熒光燈; 移液管等。第8頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三五、試劑配制 1、提取介質50mmol/L(pH7.0)磷酸緩沖液。 2、反應介質50mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液, 內含77.12mol/L硝基四唑藍, 0.1mmol/L EDTA, 13.37mmol/L蛋氨酸。 3、80.2mol/L核黃素溶液: 用含有0.1mmol/L EDTA的50mmol/L(p

4、H7.8)的磷酸緩沖液配制。SOD反應混合液3.9ml反應介質0.1ml 80.2mol/L核黃素溶液第9頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三六、植物材料:玉米葉片: 完全液培養(yǎng)苗 缺素液培養(yǎng)苗第10頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三七、操作步驟將玉米葉片剪細混合均勻稱0.2g(用保鮮膜包好放低溫冰箱預凍) 研磨成勻漿再加入3ml緩沖液,研磨均勻后, 將勻漿液倒入聚乙烯離心管中低溫(04)下、4800rpm離心10min上清液即為酶液，將上清液倒入小青霉瓶，低溫下貯存，供SOD活性測定。 1、酶液的提取：加入2ml冰冷的0.05mol/LpH7.0

5、磷酸緩沖液及少量的石英砂 研缽第11頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三 2.SOD活性測定： 取6支試管, 編號, 按下表加入試劑。將1號管用黑紙袋套上, 與其它試管一起放熒光燈下, 光強3000Lx照光10min, 到時間后關燈, 用黑布罩上試管(如室內光線不強, 不罩黑布也可), 以1號試管溶液為參比, 測定樣品在560nm處的吸光度。不加酶的2號試管溶液顏色最深; 加入酶的由于SOD抑制了硝基四唑藍的光還原,顏色變淺。第12頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三2、活性測定：取6支干燥的、玻璃質量一致的普通試管，按下表順序加入試劑試管編號123

6、456參比對照管 正常葉片缺素葉片酶液100l100l100l100l提取介質(磷酸緩沖液)100l100lSOD反應混合液(含核黃素) 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml各管要充分搖均勻放暗處 置于光強3000Lx照光10min560nm吸光值？第13頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三第14頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三式中：Ack為2號對照管溶液在560nm處的吸光度值; AE為樣品測定管溶液在560nm處的吸光值; V為酶液總體積（ml)； W為提取酶液的植物材料的鮮重（g)； Vt為測定時酶液的用量(ml)。八、結果計算：

7、 （Ack-AE)V SOD活性(U/g鮮重) AckWVt50 一個酶活單位定義為將硝基四唑藍的還原抑制到對照一半(50)時所需的酶量。第15頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三 九、注意事項: 1.所用試管的玻璃質量要一樣。包括厚度、直徑、質量等。 2.照光條件要一致。照光時試管放的高度、背景等。 3.要多做對照消除日光燈管的光質差異。 4. 植物組織中的酚類物質對測定有干擾，對酚類含量高的材料提取酶液時可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5.結果計算時要用相鄰對照管代入公式計算。第16頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三 十、思考題: 1.在SOD活性測定中為什么設照光和暗中兩個對照管。 2.影響本實驗準確性的主要因素是什么？應如何克服？第17頁，共18頁，2022年，5月20日，10點28分，星期三1.下次實驗：改良半葉法測定植物光合速率2. 請按植物生理生化實驗B補充材料認真書寫預習報