1、關于生物化學實驗課件課件第一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗一 糖類的性質實驗（實驗一和二）實驗二 氨基酸的分離鑒定-紙層析法（7）實驗三 蛋白質及氨基酸的呈色反應（8）實驗四 酶的特性（18）實驗五 脂肪碘值的測定(5)實驗六 蛋白質的等電點測定和沉淀反應(9)實驗七 米氏常數的測定(20)實驗八 維生素C的定量測定(23)第二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗課是提高教學質量的重要環節。通過實驗鞏固理論知識，訓練基本操作，培養獨立工作的能力，為了保證實驗順利進行，實驗前應注意以下幾點：實驗室規則及安全、衛生教育第三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年

2、6月1、每次實驗前必須詳細預習實驗講義，明確實驗原理及操作步驟，并在記錄本上擬出操作時的注意事項。2、實驗時自覺遵守課堂紀律，嚴格按操作規程操作，既要獨立操作又要與其他同學配合。3、實驗時應嚴格按照實驗步驟及試劑用量進行操作，不能任意變更。不熟悉的儀器和設備，應先請老師講解后使用，切勿隨意亂動。 第四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月4、實驗進行時，必須隨時把觀察得到的現象和實驗數據，如實地記錄在記錄本上，不得記錄在其他紙上，要養成作原始記錄的良好習慣。 5、實驗時如有問題發生，應首先用自己學過的知識，獨立思考加以解決，培養獨立分析問題和解決問題的能力，如自己不能解決，可與指導老師

3、共同討論研究，提出解決問題的辦法。 6、精心愛護各種儀器。實驗所需的一般儀器按規定借領，歸還。完成實驗后應將儀器洗凈倒置于實驗柜中并排列整齊。如有損壞或遺失，需要說明原因，經指導教師簽名后方可補領，并按規定賠償。第五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月7、精密貴重儀器每次使用后應登記姓名并記錄儀器使用情況。要隨時保持儀器的清潔。如發生故障，應立即停止使用并報告指導教師。8、驗中所用得玻璃儀器及其它器皿，應洗滌干凈，桌面、地面要保持清潔有序，實驗完畢后，所用儀器設備應恢復原狀。第六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月9、必須遵守實驗室規則：（1）室內不得高聲談笑，保持安靜的實

4、驗環境。（2）愛護儀器，不得浪費藥品，節省水電，遵守學生守則及實驗室安全、衛生等制度。（3）公用儀器及試劑瓶用完后應及不要移動原有的位置。注意瓶塞切勿蓋錯，以免污染試劑，用畢后立即放回原處。對于有害藥品，應按實驗室規定取用。（4）濾紙、火柴棒、碎玻璃等應投入廢品袋，切勿丟入水池，以保證下水道暢通。第七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（5）如用儀器有損壞，立即向指導老師報告，再行登記。（6）保持實驗室的整齊清潔，個人所帶與實驗無關的東西，如書包等要放在實驗室指定地方，不得亂放在實驗桌上。（7）由學生輪流值日，值日生要負責當天實驗室的衛生、安全和服務性的工作，特別注意打掃水槽中廢棄物

5、。（8）最后一組實驗人員，離開實驗室時，檢查水、電、門、窗是否關閉，以保證實驗室安全。（9）如有突發事件（起火、試劑腐蝕傷人）發生，不要驚慌失措，應妥善處置（使用滅火機、關閉電源等）。第八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗一 糖類的性質實驗第九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月糖類的重要鑒別方法是 反應和反應。糖類、苷類及其他含糖物質與 萘酚和濃硫酸呈紫紅色的環的反應稱為 反應，該反應可用于糖類和非糖物質的鑒別。酮糖糖加入間苯二酚和鹽酸能產生紅色的反應稱為反應，該反應可用于酮糖和醛糖的鑒別。如己酮糖加入間苯二酚和濃鹽酸，加熱后迅速產生紅色，而同樣條件下己醛糖的反應速

6、度要慢得多。第十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月非還原性糖在酸存在下，加熱水解后產生還原性的單糖。淀粉的水解是逐步發生的，先水解成紫糊精，再水解成紅糊精、無色糊精、麥芽糖，最終水解成葡萄糖。用碘液可以檢查這種水解過程。完全水解后，可用試劑加以證實。多糖類遇濃硫酸被水解成單糖，單糖被濃硫酸脫水閉環，形成糠醛類化合物，在濃硫酸存在下與萘酚發生酚醛縮合反應，生成紫紅色縮合物。第十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的：1、了解糖類某些顏色反應的原理；2、學習應用糖的顏色反應鑒別糖類的方法；3、學習幾種常用的鑒定糖類還原性的方法及 其原理。第十二張，PPT共一百二十

7、七頁，創作于2022年6月二、實驗原理(一)顏色反應1. -萘酚反應糖在濃無機酸（硫酸或鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與-萘酚生成紫紅色物質。注意：因糠醛及糠醛衍生物對此反應均呈陽性，不是糖類的特異反應。第十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月OCHO-CH2OH第十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2. 間苯二酚反應 在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚作用生成紅色物質。此反應是酮糖的特異反應。因為醛糖在同樣條件下呈色反應緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時間較長時，才呈微弱的陽性反應。第十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(

8、二) 還原作用許多糖類由于其分子中含有自由的或潛在的醛基或酮基，因此在堿性溶液中能將銅、鐵、銀等金屬離子還原，同時糖類本身被氧化成糖酸及其他產物。糖類這種性質常被利用于檢測糖的還原性及還原糖的定量測定。本實驗所用的試劑為斐林試劑和本尼迪克特試劑。它們都是Cu2的堿性溶液，能使還原糖氧化而本身被還原成紅色（顆粒大）或黃色（顆粒小）的Cu2O沉淀。本尼迪克特試劑是改良的斐林試劑。（見P100,101腳注）第十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：試管、試管架、滴管、水浴鍋（或電爐）2、試劑： 1%葡萄糖溶液， 1%果糖溶液， 1%蔗糖溶液， 1%淀粉， 1%麥芽糖

9、溶液， 0.1%糠醛溶液， 濃硫酸， 莫氏試劑， 塞氏試劑， 斐林試劑， 本尼迪克特試劑第十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟 1、-萘酚反應1%葡萄溶液1%果糖溶液各加1ml 各加2滴 各加1ml 1%蔗糖溶液莫氏試劑 濃硫酸1%淀粉溶液 0.1%糠醛溶液 5支試管混勻觀察記錄各管顏色第十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月Molisch反應（-萘酚反應）濃H2SO4界面：顯色- 鑒定：所有的糖類均可顯色第十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 2. 間苯二酚反應 1%葡萄糖溶液 各加0.5ml 各加5ml 1%果糖溶液 賽氏試劑 1%蔗糖溶

10、液 3支試管混 均同時置沸水浴中觀察記錄各管顏色第二十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月3、糖與斐林試劑的反應1）檢驗試劑： 1ml斐林試劑或1ml本尼迪克特試劑4ml蒸餾水 1支試管加熱煮沸觀察現象第二十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2）實驗過程 2ml斐林試劑 1%葡萄糖溶液 各加 1ml 1%果糖溶液 或 1%蔗糖溶液 1%麥芽糖溶液 2ml本尼迪克特 1%淀粉溶液 試劑 5支試管觀察記錄各管顏色置沸水浴中加熱取出冷卻第二十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗數據記錄（P99,102）六、實驗思考題： 1. 可用何種顏色反應鑒別酮糖的存在

11、？ 2. -萘酚反應的原理是什么？ 3. 斐林試劑、本尼迪克特試劑檢驗糖的 原理是什么？七、預習：P109 實驗二第二十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗二 脂肪碘值的測定第二十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗時取樣多少決定于油脂樣品的碘值。可參考表1與表2： 第二十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的 1、學習和掌握測定脂肪碘值的原理和方法。 2、了解和學習空白對照實驗的原理和方法教材第6、7頁第二十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月二、實驗原理碘值（價）是指100g脂肪在一定條件下吸收碘的克數。碘值是鑒別脂肪的一個

12、重要常數，可用以判斷脂肪所含脂肪酸的不飽和程度。脂肪中常含有不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸具有一個或多個雙鍵，能與鹵素起加成作用而吸收鹵素。第二十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月常用碘與脂肪中不飽和脂肪酸的雙鍵起加成作用。脂肪的不飽和程度越高，所含的不飽和脂肪酸越多，與其雙鍵起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不飽和度。 I2+CH=CHCHICHI第二十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 本實驗用溴化碘(Hanus試劑)代替碘。用一定量(必須過量)溴化碘和待測的脂肪作用后，用硫代硫酸鈉滴定的方法測定溴化碘的剩余量，然后計算出待測脂肪吸收的碘量，求

13、得脂肪的碘值。 第二十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月加成作用：IBr+CH=CHCHICHBr 剩余溴化碘中碘的釋放： IBr + KI KBr + I2再用硫代硫酸鈉滴定釋放出來的碘： I2 +2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI第三十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材： 碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平2、試劑： 花生油，Hanus試劑, 四氯化碳，10%碘化鉀溶液 0.1084mol/L 硫代硫酸鈉溶液， 1%淀粉溶液第三十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟0.3-0.4g油兩份 潔凈碘瓶 加

14、入10ml四氯化碳 輕輕振動 加入Hanus試劑25ml塞好瓶塞，并在塞子與瓶口間加入數滴KI溶液 混勻 置暗處30分鐘(25度) 打開瓶塞，將KI流入瓶內 加入KI 10ml和蒸餾水50ml,將瓶塞和瓶頸上的液體沖入瓶內 混勻 用0.1ml/L的Na2S2O3滴定至淡黃色 加入1%淀粉溶液約1ml繼續滴定 至接近滴定終點(藍色極淡) 加塞用力振蕩 再滴至滴定終點（水層與非水層全部都無色） 另外再做一份空白實驗。(除不加樣品外，其它操作同樣品實驗。)第三十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月附注 （1）碘瓶必須潔凈、干燥，否則油中含有水分，引起反應不完全。 （2）加碘試劑后，如發現

15、碘瓶中顏色變淺褐色時，表明試劑不夠，必須再添加1015 mL試劑。（3）如加入碘試劑后，液體變濁，這表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。（4）將近滴定終點時，用力振蕩是本滴定成敗的關鍵之一，否則容易滴加過頭或不足。如震蕩不夠，CCl4展會出現紫或紅色，此時應用力振蕩，使碘進入水層。（5）淀粉溶液不宜加得過早，否則滴定值偏高。第三十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗結果記錄 1、原始數據記錄 1）花生油的質量 W值 2）Na2S2O3摩爾濃度 C值第三十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2）滴定結果記錄： A為滴定空白所消耗的Na2S2O3溶液m

16、L數；B為滴定樣品所消耗的Na2S2O3溶液mL數；c為Na2S2O3溶液的摩爾濃度。最后求出平均碘值。第三十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月六、思考題： 1、何謂碘值？具有什么意義？ 2、何謂空白溶液和空白實驗？空白實驗有何意義？七、預習：P122 實驗三 氨基酸的分離鑒定-紙層析法第三十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月第三十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、層析技術簡介 層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過

17、此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達到分離。第三十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 層析法是近代生物化學最常用的分析方法之一，運用這種方法可以分離性質極為相似，而用一般化學方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質等。第三十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月二、層析的分類1、按分離相狀態分類 ： 根據層析過程中的固定相和流動相進行分類，大致可以分以下幾類 ：（1）氣相層析是以氣體為流動相的層析方法，稱之為氣相層析。根據固定相的性質不同又可以分為氣-固層析(GSC)和氣-液層析(GLC)。前者是指載體表面含有許多吸附基團的固體吸附介

18、質，后者是指載體表面涂有一層薄薄液體分子制成的介質。 第四十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（2）液相層析是以液體為流動相的層析方法，稱之為液相層析。同理，根據固定相的性質不同又可以把液相層析分為液-固層析(LSC)和液-液層析(LLC)。液相層析的固定相性質與氣相層析相近。（3）超臨界層析是以流體為流動相的層析方式，稱為超臨界層析(SFC)。它是利用流動相溶劑分子的氣態和液態臨界點的條件下進行分離的，這種分離方法更具專一性。 第四十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 2、按層析的分離機理分類 （1）排阻層析利用凝膠層析介質(固定相)交聯度的不同所形成的網狀孔徑的大

19、小，在層析時能阻止比網孔直徑大的生物大分子通過。利用流動相中溶質的分子量大小差異而進行分離的一種方法，稱之為排阻層析。 第四十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（2）離子交換層析利用固定相球形介質表面活性基團經化學鍵合方法，將具有交換能力的離子基團在固定相上面，這些離子基團可以與流動相中離子發生可逆性離子交換反應而進行分離的方法，稱之為離子交換層析。第四十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（3）吸附層析利用吸附層析介質表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質產生吸附作用，利用其對不同溶質吸附能力的強弱而進行分離的一種方法，稱之為吸附層析。 第四十四張，PPT共一

20、百二十七頁，創作于2022年6月（4）分配層析 被分離組分在固定相和流動相中不斷發生吸附和解吸附的作用，在移動的過程中物質在兩相之間進行分配。利用被分離物質在兩相中分配系數的差異而進行分離的一種方法，稱之為分配層析。 第四十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（5）親和層析 在固定相載體表面偶聯具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動相中溶質分子發生可逆的特異性結合而進行分離的一種方法，稱之為親和層析。第四十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 （6）金屬螯合層析 利用固定相載體上偶聯的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發生螯合作用，結合在固定相上，二價金屬離子可以與流

21、動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發生特異螯合作用而進行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。第四十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（7）疏水層析 利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離的方法，稱之為疏水層析。第四十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（8）反向層析 利用固定相載體上偶聯的疏水性較強的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動相來分離不同極性的物質的方法，稱之為反相層析。 （9）聚焦層析 利用固定相載體上偶聯的載體兩性電解質分子，在層析過程中所形成的pH

22、梯度，并與流動相中不同等電點的分子發生聚焦反應進行分離的方法，稱之為聚焦層析。 第四十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（10）灌注層析 利用剛性較強的層析介質顆粒中具有的不同大小貫穿孔與流動相中溶質分子分子量的差異進行分離的方法，稱之為灌注層析。第五十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗三 氨基酸的分離鑒定-紙層析法第五十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月氨基酸的分離鑒定-紙層析法一、實驗目的通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法第五十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月二、實驗原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。

23、(其原理參見P33)層析溶劑由有機溶劑(或稱有機相，是流動的、被水飽和的，構成流動相)和水(通常是被結合在濾紙上，構成固定相)組成。(P34紙層析原理：在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間第五十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月紙層析原理：在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相，由于纖維素與水的氫鍵作用，使水不易擴散，并能與跟水混合的溶劑(有機相)形成類似不相混合的兩相。當有機相沿紙流動經過層析點時，層析點上的溶質就在水相和有機相之間進行分配，有一部分溶質離開原點隨有機相移動而進入無溶質的區域，這時又重新進行分配，一部分溶質從有機相進入水相。當有機相不斷流動時，溶質就沿著有機

24、相流動的方向移動，不斷進行分配。溶質中各組分的分配系數不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。第五十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的： 原點到層析點中心的距離 Rf 原點到溶劑前沿的距離在一定的條件下某種物質的Rf值是常數，Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量、展層方式、層析溫度和pH等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。第五十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：層析缸（或標本缸），毛細管，噴霧器，電吹風，培養皿，層析濾紙(質地必須均一、平整及厚薄均勻，要有一

25、定的強度。新華1號或3號濾紙(或Whatman 1號或3號濾紙)2、試劑：0.5%的賴氨酸，0.5%的脯氨酸，0.5%的纈氨酸，0.5%的苯丙氨酸，0.5%的混合氨基.酸，顯色劑，擴展劑第五十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟1取擴展劑約5ml置于小燒杯中做平衡溶劑，然后將小燒杯置于密閉的層析缸中（或標本缸）。2取層析濾紙（長22cm，寬14cm）一張。在紙的一端距邊緣2-3cm 處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm 作一個記號(“”型而不是“.”型)，共作5個記號作為點樣點；另外，沿展層方向在濾紙兩邊距邊緣約0.5-1cm處對稱地劃兩條直線，分別將其四等分，各

26、取其三個等分點作為縫線點。第五十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月3、點樣 用毛細管將各種氨基酸樣品分別點在這6個點樣點位置上(注意速度要快，否則易擴散開)，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。4擴展 用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸，將盛有約20ml擴展劑的培養皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需要低于點樣紙1cm）。待溶劑上升15-20cm時取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或者用吹風機吹干。第五十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月5顯色 用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱

27、中烘烤5分鐘（100）或用熱風吹干即可以顯出個層析斑點。6計算各種氨基酸的Rf值五、實驗結果記錄第五十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月六、思考題：1何謂紙層析法？2何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？3怎樣制備擴展劑？預習：實驗四 蛋白質及氨基酸的呈色反應。 P125第六十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實 驗 四 蛋白質及氨基酸的呈色反應第六十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的1、了解構成蛋白質的基本結構單位及主要連接方式。2、了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理。3學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法第六十二張，PPT共一百二十

28、七頁，創作于2022年6月二、實驗原理（一）雙縮脲反應雙縮脲反應:尿素加熱至180左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與Cu2+結合生成紫紅色化合物。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，能發生雙縮脲反應。這可用于蛋白質的定性或定量測定。第六十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月第六十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月第六十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月注意:雙縮脲反應不僅為含有兩個以上肽鍵的物質所特有，許多含有一個肽鍵和一個氨基的物質也能發生此反應 如 CS-NH2，-CH2-NH2，O=C C=O 等。 NH2 NH2NH3也干

29、擾此反應，因為NH3與Cu2+可生成暗藍色的絡離子( Cu(NH3)42+ ，四氨合銅)。因此，一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。第六十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（二）茚三酮反應除脯氨酸，羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。第六十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月第六十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月-丙氨酸、氨和許多一級胺都呈正反應 (尿素、馬尿酸和肽鍵上的亞氨基不呈現此反應。)因此，雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮呈陽

30、性反應的不一定是蛋白質或氨基酸。在定性定量測定中，應嚴防干擾物存在。該反應十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。第六十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月茚三酮反應分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮。第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。(此反應的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同的pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。)第七十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（三）黃色反應 含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨

31、酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。(多數蛋白質分子含有帶苯環的氨基酸，所以有黃色反應，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的濃硫酸才有黃色反應，該反應非常靈敏。)第七十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（四）考馬斯亮藍反應考馬斯亮藍G250具有紅色和藍色兩種色調。在酸性溶液中，其以游離態存在呈棕紅色；當它與蛋白質通過疏水作用結合后變為藍色。(它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍，反應速度快，約在2分鐘達到平衡，在室溫1小時內穩定，常用來定量測定蛋白質含量)第七十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：電爐、試管

32、、試管架、吸管、吸管架等2、試劑：尿素, 1%CuSO4溶液， 10%NaOH溶液2%卵清蛋白溶液，0.5%甘氨酸溶液，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮乙醇溶液，0.5%苯酚溶液，濃硝酸，0.3%色氨酸0.3%酪氨酸溶液，考馬斯亮藍染液。第七十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟雙縮脲反應取少量尿素結晶于干燥試管中 微火加熱熔化 硬化時停止加熱 冷后，加10%NaOH溶液約1ml 振蕩混勻 加一滴1%CuSO4溶液 再振蕩 觀察記錄另取一只試管 加卵清蛋白溶液約1ml 和10%NaOH溶液約2ml 搖勻 加1%CuSO4溶液2滴 隨加隨搖 觀察記錄 第七十四張，PP

33、T共一百二十七頁，創作于2022年6月 茚三酮反應(1)取兩支試管 分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液各1ml 再各加0.1%茚三酮水溶液0.5ml 混勻 沸水浴中加熱12分鐘 觀察(2)在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液 風干 在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液 微火旁烘干顯色 觀察第七十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 黃色反應向6支試管中分別按下表加入試劑，觀察各試管出現的現象，待各管出現黃色后，與室溫下逐滴加入 10%NaOH溶液至堿性，觀察顏色變化。 第七十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 考馬斯亮藍反應 取2支試管，按下表操作：第七十七張，PPT共一

34、百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗結果記錄 見P131-132表六、思考題：通過本實驗你掌握了幾種鑒定蛋白質和氨基酸的方法？它們的原理是什么？ 七、預習：P133實驗五 蛋白質等電點測定和沉淀反應第七十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗五 蛋白質的等電點測定和沉淀反應第七十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的1、了解蛋白質的兩性解離性質；2、學習測定蛋白質等電點的方法；3、加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識；4、了解沉淀蛋白質的幾種方法及其實用意義；5、了解蛋白質變性與沉淀的關系。第八十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月二、實驗原理(

35、一)蛋白質的等電點的測定蛋白質是兩性電解質，在蛋白質溶液中存在下列平衡(見P133圖)。 COOH P (蛋白質分子) NH2 COO- COO- COOH P P P NH2 NH3+ NH3+ 陰離子 兼性離子 陽離子 pHpI pH=pI pHpI電場中： 移向陽極 不移動 移向陰極+ H+ H+ OH-+ OH-第八十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月蛋白質的等電點(pI) ：蛋白質分子的解離狀態和解離程度受溶液酸堿度的影響，當溶液的pH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動 ，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點

36、。不同蛋白質各有其特異的等電點(pI)。在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低(或沉淀量最多)時的溶液pH值。本實驗借觀察不同pH緩沖液中溶解度以測定酪蛋白的等電點。第八十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(二)蛋白質的沉淀及變性 在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質的沉淀反應可以分為兩類：(1)可逆的沉淀反應(不變性，如鹽析作用或低溫作用下用乙醇或丙酮短時間作用)(2)不可逆的沉淀反應(變性，如加熱沉淀與

37、凝固、與重金屬離子或某些有機酸反應等)第八十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(注意：蛋白質變性后，由于維持溶液穩定的條件仍然存在(如電荷)，并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性)第八十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：水浴鍋 溫度計 容量瓶 錐形瓶 吸管 試管 吸管架 試管架2、試劑： 0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液：1.0mol/L醋酸溶液, 0.1mol/L醋酸溶液，0.01mol/L醋酸溶液，蛋白質溶液，pH4.7HAc-NaAc的緩沖溶液，3%硝酸銀溶液，5%三氯乙酸溶液，乙醇，飽和硫酸銨溶液，硫酸銨

38、結晶粉末，0.1mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L氫氧化鈉溶液，0.05mol/L碳酸鈉溶液，甲基紅溶液，2%氯化鋇溶液第八十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟(一) 蛋白質的等電點的測定1、取同樣規格的試管4支，按下表順序分別精確的加入各試劑，然后混勻。(注意：在測定等電點實驗中，要求各種試劑的濃度和加入量相當準確)第八十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2、向以上各試管加酪蛋白的NaAc溶液 1mL(加一管，搖勻一管)。此時1，2，3，4管的pH依次為5.9，5.3，4.7，3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度(最混濁的一管的pH即

39、為酪蛋白的等電點)。第八十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(二)蛋白質的沉淀及變性1、蛋白質的鹽析：無機鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)的濃溶液能析出蛋白質。鹽的濃度不同，析出的蛋白質也不同。(如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出)蛋白質溶液5mL于試管中 加5mL飽和硫酸銨 混均靜置數分鐘倒出少量沉淀 加少量水 觀察是否溶解(？) 第八十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2、重金屬離子沉淀蛋白質(重金屬離子與蛋白質結合成不溶于水的復合物)取蛋白質溶液 2mL 于試管中 加3%硝酸銀溶液1-2滴 振蕩 放置片刻 傾去上清液 向沉淀

40、中加入少量水 觀察是否溶解(？)第八十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月3、某些有機酸沉淀蛋白質(PhpI)蛋白質溶液2mL于試管中 加5%三氯乙酸溶液1mL 振蕩 放置片刻 觀察現象 傾去上清液 向沉淀中加入少量水 觀察是否溶解(？)4、有機溶劑沉淀蛋白質(蛋白質脫去水化層，降低介電常數)蛋白質溶液2mL 乙醇2mL 振蕩 觀察沉淀？第九十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月5、乙醇引起的變性與沉淀 取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：第九十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗結果記錄：見P140-142六、思考題：何謂蛋白質的等電點和沉淀反應？

41、有何實用意義？七、預習： 實驗六 酶的特性(P169)第九十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗六 酶的特性第九十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的加深對酶的性質的認識二、實驗原理（一）溫度對酶活力的影響：酶的催化作用受溫度的影響。在最適溫度下，酶的反應速度最高。(大多數動物酶的最適溫度37-40，植物酶的最適溫度為50-60。)高溫可以使酶失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。第九十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月酶對溫度的穩定性與其存在形式有關。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100，其活性并無明顯改變，但在100的溶液中卻很快

42、地完全失去活性。淀粉被唾液淀粉酶水解的產物有糊精和麥芽糖。淀粉遇碘呈藍色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈藍色、紫色、暗褐色或紅色、不呈色。麥芽糖遇碘也不呈色。因此，在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈現的顏色來判斷。第九十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（二）pH對酶活性的影響：酶的活力受環境pH的影響極為顯著。不同酶的最適pH值不同。本實驗觀察pH對唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制：酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為唾液淀粉酶的抑制劑。(四)酶的專一性：酶具有高度的專一性

43、。本實驗以唾液淀粉酶和蔗糖酶對淀粉和蔗糖的作用為例，來說明酶的專一性。(淀粉和蔗糖無還原性。唾液淀粉酶水解淀粉最終生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解生成還原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用本尼迪克特試劑檢查糖的還原性。)第九十六張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：試管及試管架 恒溫水浴鍋 吸管 滴管 錐形瓶 電爐 石棉網 燒杯 冰塊 塑料盆2試劑：0.2%淀粉的0.3%氯化鈉溶液(新鮮配制)；0.5%淀粉的0.3%NaCl溶液(新鮮配制)；1%淀粉的0.3%氯化鈉溶液(新鮮配制)；稀釋200倍的唾液(新鮮配制)；KI-I

44、2溶液(用前稀釋10倍)；0.2mol/LNa2HPO4溶液；0.1mol/L檸檬酸溶液；四種pH試紙(pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8)；0.1%的淀粉溶液；1% NaCl溶液；1%CuSO4溶液；1%Na2SO4溶液；2%蔗糖溶液；蔗糖酶溶液第九十七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟（一）溫度對酶活力的影響 取3支試管，編號，按下表加入試劑：搖勻1,3號管37水浴2號管冰水浴10分鐘一半一半加KI-I237水浴 10分鐘加KI-I2記錄現象現象第九十八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月（二）pH對酶活性的影響1、配制緩沖液：取4個50mL錐

45、形瓶，編號，用吸管按P171表添加0.2mol/L Na2HPO4和0.1mol/l檸檬酸溶液以制備pH5.0-8.0的4種緩沖液（PH5.0、PH5.8、PH6.8、PH8.0）2、過程 取4支試管編 號pH緩沖液3mL0.5%淀粉2 mL間隔1min加已稀釋200倍的唾液2 mL混勻依次于37水浴中保溫每隔1分鐘用白瓷板檢驗H6.8的試管淀粉水解程度各管間隔1min加1-2滴KI-I2溶液觀察各管顏色變化2分鐘顯示棕黃色后第九十九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月檢驗方法:待向第4管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴KI-I2溶液，檢

46、驗淀粉水解程度。待混合液變為棕黃色時，向所有試管依次添加1-2滴KI-I2溶液。第一百張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(三)唾液淀粉酶的活化和抑制取4支試管，編號，按下表加入各試劑： 解釋結果，說明本實驗第3管的意義。(注意：保溫時間可根據各人唾液淀粉酶活力調整。)第一百零一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月(四)酶的專一性：1、淀粉酶的專一性(見P174表) (注意：唾液中除含淀粉酶外還含有少量的麥芽糖酶) 2、蔗糖酶的專一性(見P175表，與上表區別在于37恒溫水浴中保溫5min)第一百零二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗結果記錄：見P175

47、-177六、思考題：1、什么是酶的最適溫度和最適 pH？2、什么是酶的活化劑？、什么是酶的抑制劑？與變性劑有何區別？3、本實驗結果如何證明酶的專一性？預習： 實驗七 米氏常數的測定(P181)第一百零三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月實驗七 米氏常數的測定第一百零四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月一、實驗目的1、了解底物濃度對酶促反應速度的影響。2、學習測定米氏常數（Km）的原理和方法。第一百零五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月VmaxSKm +S 1 vKm 1 1VmaxSVmaxV=二、實驗原理 米氏方程:改為雙倒數式 ： = +第一百零六張，P

48、PT共一百二十七頁，創作于2022年6月 1 vKm 1 1VmaxSVmax = +第一百零七張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月 Km值是酶的一個特征常數，測定Km值是酶學研究中的一個重要方法。雙倒數作圖法是實驗方法測定Km值的最常用的比較方便的方法。實驗時選擇不同的S，測定相對應的V，求出兩者的倒數，以1/V對1/S作圖，則得到一斜率為Km/Vmax的直線。將直線外推與橫軸相交，由1/Km=-1/S求出Km。第一百零八張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月本實驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法測定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一個酶，

49、它催化蛋白質中堿性氨基酸（L-精氨酸和L-賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法(原理參見P148)判斷自由氨基增加的數量來追蹤反應。第一百零九張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月三、器材及試劑1、器材：錐形瓶 堿式滴定管 滴定臺 蝴蝶夾 吸管 量筒 恒溫水浴鍋2、試劑：pH8.5酪蛋白溶液(10、20、30、40g/ L)；40g/ L胰蛋白酶溶液；純甲醛溶液；酚酞(2.5g/ L乙醇)；標準NaOH(約0.1mol/L)溶液第一百一十張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月四、實驗步驟1、6個小錐形瓶 分別加入2.5mL甲醛溶液和1滴酚酞

50、分別滴加0.1ml/LNaOH溶液 至混合物呈為微粉紅色(所有瓶中顏色須一致)2、另取一大錐形瓶 加入30mL酪蛋白溶液 37水浴保溫10min （同時胰蛋白酶溶液也37水浴中保溫10 min）第一百一十一張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月3、精確地取5mL酶液 加到酪蛋白溶液中，同時記時 充分混合 隨即取5mL反應混合物(作為0時樣品) 吹至上述含甲醛的小錐形瓶中 各加入酚酞（1滴酚酞/ml混合液） 用0.1mol/LNaOH滴定至呈微弱但持的粉紅色 在接近終點時，再加入指示劑(每mLNaOH溶液加入1滴酚酞) 繼續滴定至終點 記下所消耗NaOH的mL數4、在2、4、6、8和10

51、min時分別取出5mL消化樣品，準確地照上法操作，在每一個樣品中滴定終點的顏色應當是一致的，用增加的滴定度對時間作圖，測定初速度。第一百一十二張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月5、用不同濃度的酪蛋白溶液（10，20，30g/L ，40g/L ）測定不同底物濃度時的活力。6、用實驗測得的結果，以1/V對1/S作圖，求出Vmax和Km的數值第一百一十三張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月五、實驗結果記錄：1、原始數據記錄：不同濃度樣品在不同反應時間的NaOH滴定量(m)第一百一十四張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月2、數據處理1)用增加的滴定度對時間(m-t)作圖，測定初速度V02) 用不同濃度的酪蛋白溶液測定不同底物濃度時的反應初速度。3) 以1/V對1/S作圖，求出Vmax和Km的數值第一百一十五張，PPT共一百二十七頁，創作于2022年6月六、思考題：1、如何正確測定酶促反應速度？