1、小鼠CD40Ig基因真核表達質粒的構建及鑒定【摘要】目的:構建含小鼠D40Ig基因的真核表達載體，為誘導供體特異性移植物的免疫耐受的基因治療作準備。方法:以小鼠脾臟總RNA為模板，以RT-PR法克隆小鼠D40胞外段DNA及IgG2aF段DNA；另以pEGFP-N1質粒為模板獲得綠色熒光蛋白GFP基因。將所得基因片段插入真核表達載體pD516中得到重組質粒pD516-D40-IgG-GFP，測序鑒定正確后，用脂質體2000將其轉染人胚腎上皮細胞HEK293細胞，熒光顯微鏡下觀察交融蛋白的表達。結果:成功構建了小鼠D40Ig基因真核表達質粒pD516-D40-IgG-GFP，并在HEK293細胞中

2、實現表達。結論:小鼠D40Ig基因真核表達質粒pD516-D40-IgG-GFP構建成功，為誘導供體特異性移植物免疫耐受的研究奠定了基矗【關鍵詞】D40Ig質粒真核表達載體Abstrat:bjetive:TnstrutaeukarytiexpressinvetrendingurineD40Iggeneandakepreparatinfrthegenetherapyfindutinfdnr-speifiiunlgitlerane.ethds:TheDNAftheextraellulardainfurineD40geneandIgG2aFgeneereaplifiedbyRT-PRfrthetta

3、lRNAislatedfrtheusespleen,andthegreenfluresentprtEin(GFP)geneasaplifiedbyPRiththeplasidpEGFP-N1astheteplate.ThenthegenesereinsertedinttheeukarytiexpressinvetrpD516,theresultantrebinantplasidasnfiredbyseqening.Thentherebinantplasidastransfetedinthuanebrynikidneyell293(HEK293)usingLipfetaine2000,theex

4、pressedfusinprteinasbservedbyflureseneirspy.Results:TheeukarytiexpressinplasidpD516-D40-IgG-GFPassuessfullynstruted,andituldberretlyexpressedinHEK293ells.nlusin:ThesuessfullynstrutinftheeukarytiexpressinplasidpD516-D40-IgG-GFPhaslaidthefundatinfrthestudyfindutinfdnr-speifiiunlgitlerane.Keyrds:D40Ig;

5、plasid;eukarytiexpressinvetr器官移植是當今治療終末期臟器衰竭的有效方法，但免疫排擠是器官移植后長期生存的一大難題。T細胞是介導排異反響的主要細胞，D40/D40L通路在T細胞的激活過程中發揮著重要作用，因此阻斷D40/D40L間的互相作用，可以誘導宿主對移植物的低排擠反響性。由此我們克隆了小鼠D40分子胞外區和IgG2a分子F段的DNA，并以pEGFP-N1質粒為模板進展PR，獲得GFP基因，經酶切連接插入真核表達載體pD516，制備出重組質粒pD516-D40-IgG-GFP，轉染293細胞后見GFP表達，證本質粒pD516-D40-IgG-GFP構建成功，從而為

6、下一步構建含D40Ig基因的腺病毒載體作好了準備，為研究阻斷D40/D40L通路誘導宿主對移植物的低排擠反響性奠定了基矗1材料和方法1.1實驗動物Balb-小鼠，6周齡,雌性,購自北京大學醫學院實驗動物部。1.2質粒、菌株、細胞株和主要試劑質粒pEGFP-N1、pGE-T載體質粒、Eli.DH5a天根公司。低代次HEK293細胞株本元正陽。AdaxTKitE試劑盒irbixBisystes，In.。Taq酶、T4DNA連接酶Takara公司。限制性核酸內切酶Xa、BglII、HindIIIBilabs。Trizl試劑、Lipfetaine2000Invitrgen。逆轉錄試劑盒、PRaster

7、ixBI。質粒提娶膠純化試劑盒QIAGEN。DE高糖培養基、胎牛血清、胰酶Gib。引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究中心完成。1.3構建小鼠D40Ig基因真核表達質粒1.3.1小鼠脾臟總RNA的提取：將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出脾臟，參加液氮研磨后，用Trizl試劑提取總RNA，方法按產品說明進展。1.3.2D40、IgG2aF、GFP基因的制備：以小鼠脾臟總RNA為模板，lig-dT為引物，RT-PR合成DNA，再以此DNA為模板，用D40和IgGF特異引物進展PR擴增，另以pEGFP-N1質粒為模板進展PR擴增，引物及PR反響條件見表1，分別獲得D40、IgG2aF和G

8、FP基因。1.3.3質粒pGE-IgG的構建：將IgGF的PR產物與pGE-T質粒進展TA連接反響，即10lPR產物加2l的pGE-T載體加10U的T4連接酶，16過夜。取2l的連接產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5，用藍白斑方法挑選含氨芐青霉素抗性的白斑克隆，在3lLB培養基含氨芐青霉素100g/l中37、80r/in振蕩培養過夜，提取質粒pGE-IgG并測序。1.3.4質粒p516-IgG的構建：用BglII分別消化pGE-IgG和pD516，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進展膠純化。將IgG片段和pD516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加T4連接酶16過夜進展連接反響。取5l連接產物轉化感

9、受態大腸桿菌DH5，用pD516-f和IgG-r引物組合進展菌落PR挑選正向插入的重組子見表2，將PR陽性的重組子進展細菌培養，提取質粒并測序。1.3.5質粒p516-D40-IgG交融基因的構建：用XaI分別消化D40的PR產物和p516-IgG，將D40片段和pD516-IgG線性載體進展連接方法同上。轉化大腸桿菌DH5后，用pD516-f和D40-r引物組合進展菌落PR挑選見表2，將陽性結果的重組子進展細菌培養，提取質粒并測序。1.3.6PD516-D40-IgG-GFP質粒的構建：用Hind分別消化GFP的PR產物和pD516-D40-IgG，將GFP片段和pD516-D-IgG線性載

10、體進展連接反響方法同上，用GFP-f和pD516-r引物組合進展菌落PR挑選正向插入的重組子見表2，提取質粒并測序。1.3.7PD516-D40-IgG-GFP質粒的大量制備：按QIAGENEndFreePlasidPurifiatin試劑盒說明進展制備，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證實見圖2，紫外分光光度儀測D值，過濾除菌后-20保存備用。1.3.8重組質粒轉染293細胞：在6孔板中將2.0105個細胞接種于2l含血清不含抗生素的DE中，在5%2、37培養箱中培養24h，使細胞在轉染時鋪滿平板的60%70%。用Lipfetaine2000轉染試劑介導重組質粒轉染，在無菌EP管中準備A、B兩種溶液

11、。A液：將4.0gDNA溶于250l無血清DE中，輕輕混勻；B液：將10lLipfetaine2000溶于250l無血清培養液中，輕輕混勻，室溫孵育5in。將A液和B液混合并混勻，室溫孵育20in，以形成脂質體/DNA復合物。換去6孔板中舊的培養液，重新參加2l含血清不含抗生素的DE，逐滴參加500l脂質體/DNA復合物。在5%2、37培養箱中培養24h后換液。2結果2.1獲得小鼠D40胞外區、IgG2aF段及GFP基因引物D40-f和D40-r經PR擴增的小鼠D40胞外區基因片段為572bp；引物IgG-f和IgG-r經PR擴增的小鼠IgG2aF段為700bp；引物GFP-f和GFP-r經P

12、R擴增的GFP基因片段為765bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。2.2pD516-D40-IgG-GFP真核表達質粒的成功構建2.2.1pD516-IgG的構建：pGE-T載體為3000bp的質粒，構建的pGE-IgG質粒為3700bp。pGE-T質粒的多克隆位點上游110bp處含有T7Prier序列，用T7+IgG-r引物組合可擴增出約810bp的片段，用T7prier測序證實IgG序列的正確性。將IgG片段和pD516線性載體進展連接反響，用pD516-f測序證實IgG插入序列的正確性見圖3。2.2.2pD516-D40-IgG的構建：將D40片段和pD516-IgG線性載體進展連接反響，用

13、引物pD516-f測序證實D40插入序列的正確性。2.2.3pD516-D40-IgG-GFP質粒的構建：將GFP片段和pD516-D40-IgG線性載體進展連接反響，用pD516-r測序證實GFP插入序列的正確性。D40-IgG-GFP含酶切位點的交融產物為2001bp，編碼667aa見圖4。2.3重組質粒在真核細胞內表達pD516-D40-IgG-GFP質粒抽提后在紫外分光光度計下檢測到D值為0.1257。將該質粒用Lipfetaine2000轉染293細胞的第4天開場可見零星的細胞上有GFP表達，隨著時間的延長，GFP表達的細胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細胞有綠色熒光發

14、生見圖5。3討論目前控制免疫排擠主要依靠免疫抑制劑，在臨床上也獲得了較好的療效，但長期使用免疫抑制劑存在增加時機性感染和腫瘤的發生率等副作用。近年來，大量文獻報道了使用多種生物制劑預防器官移植后的排擠反響的可行性，包括單克隆抗體、細胞因子、細胞因子可溶性受體等在動物體內和人體實驗中均獲得一定的療效。這些制劑最大的優點是能阻斷免疫反響中的特異性步驟，減少毒副作用，導致人體對外源臟器的免疫耐受，但是這些生物制劑與傳統的免疫抑制劑一樣需要終身用藥，存在免疫移植的效果不強等問題1。近年來，國內外許多學者已經嘗試采用基因治療的方法來預防移植后的排擠反響3-5。他們認為，細胞免疫應答是移植排擠的主要機制，

15、而T細胞的有效活化除了需要抗原信號第一信號外，同時也需要第二信號的協同作用，否那么T細胞將表現為無反響或凋亡。因此阻斷共刺激信號途徑，防止T細胞活化，可以誘導免疫無能iuneanergy。研究說明，作為共刺激通路之一的D40/D40L通路與B7/D28共刺激通路相比可能起著更關鍵的作用6。D40為I型跨膜糖蛋白,主要表達于B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、內皮細胞等；D40L為33kD的II型跨膜糖蛋白，主要表達于活化的D4+T淋巴細胞，局部活化的D8+T細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、血小板和巨噬細胞1。研究認為，D40/D40L交聯不僅能調節B細胞的活化，還可以促進AP細胞表達D80、D86等共

16、刺激分子，這些分子與T細胞外表的配體D28、TLA-4結合，形成對T細胞刺激的第二信號，從而使T細胞完全活化。因此，我們可以通過阻斷D40/D40L共刺激通路從而誘導宿主對移植物的低反響性。動物實驗顯示，用抗D40L單克隆抗體阻斷D40/D40L之間的互相作用可以延長移植物的存活時間7,8，但需要反復給藥以維持有效血藥濃度，并有引起血栓合并癥的危險9。Nura等10在大鼠模型中單次注入D40Ig重組腺病毒，觀察到移植肝存活時間超過300d，并出現了供體特異性耐受現象；劉荷中等11人在移植物抗宿主病GVHD小鼠中注入純化的D40Ig交融蛋白，顯著延長了小鼠的平均存活時間，提示應用基因治療的方法阻

17、斷D40/D40L通路在移植領域有宏大的開發前景。我們克隆了小鼠D40分子胞外區和IgG2a分子F段的DNA，成功構建了重組質粒pD516-D40-IgG-GFP。其真核表達載體pD516來源于Adax腺病毒載體包裝系統，該系統與目前使用最普及的AdEasy系統相比，具有效率高、有助于重組腺病毒的基因組完好性等特點。本質粒的成功構建為下一步構建腺病毒載體奠定了根底，在后續的實驗中，我們將構建含小鼠D40Ig的腺病毒注入到動物移植模型中，使移植動物可以持續表達D40Ig，從而觀察阻斷D40/D40L通路與誘導移植免疫耐受的關系，探究其潛在的臨床應用價值。【參考文獻】1Guillt,Guillnn

18、eau,athieuP,etal.Prlngedblk-adefD40-D40ligandinteratinsbygenetransferfD40Igresultsinlng-terheartallgraftsurvivalanddnr-speifihyprespnsiveness,butdesntpreventhrnirejetinJ.JIunl,2002,168(4):1600-1609.2Guillt,auffB,uturi,etal.Genetherapyintransplantatinintheyear2000:vingtardslinialappliatinsJ.GeneTher,

19、2000,7(1):14-19.3QinL,DingY,PahudDR,etal.Adenvirus-ediatedgenetransferfviralinterleukin-10inhibitstheiunerespnsetbthallantigenandadenviralantigenJ.HuGeneTher,1997,8(11):1365-1374.4lthffK,JudgeTA,GelanAE,etal.Adenvirus-edi-atedgenetransferintld-preservedliverallgrafts:sur-vivalpatternandunrespnsivenessfllingtransdutinithTLA4IgJ.Nated,1998,4(2):194-200.5Guillt,athieuP,athaleH,etal.Tleranetardiaallgraftsvialalandsysteiehanissafteradenvirus-ediatedTLA4IgexpressinJ.JIunl,2000,164(10):5258-5268.6YaadaAA,SayeghH.TheD154-D40stiulatrypathayintransplantatinJ.Transplant