1、關于抗體制藥抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第一張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics本章目的要求1、掌握單克隆抗體的概念。2、理解制備單克隆抗體的一般流程。3、理解基因工程抗體的制備。4、理解噬菌體抗體庫的基本方法、技術特點及基因工程抗體的表達。5、掌握抗體診斷試劑的分類。 第二張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics學習內容（一） 1、抗體制藥概述2、單克隆抗體制備的基本過程。3、基因工程抗體。第三張，PPT共五十

2、六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第一節 概 述1890年Behring和北里柴三郎發現白喉抗毒素,建立了血清療法,開創了抗體制藥。 1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、球蛋白，并證明抗體活性主要存在于球蛋白組分。70年代中期，日本利根川進證實了Ig的基因結構，獲得1987年的the Nobel prize。第四張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics抗體？ 是指能與相應抗原特異性結合具有免疫功能的球蛋白。抗體的產生？ 機體免疫系統受抗原刺激后

3、，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。第五張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第六張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics20世紀60年代發現多發性骨髓瘤是漿細胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現同抗體結構類似的球蛋白， 統稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結構的概念，而抗體是生物學功能的概念。第七張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Ph

4、armaceutics多克隆抗體 polyclonal antibody指由不同B細胞克隆產生的針對抗原物質中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。實際意義：（1）預防、治療感染性疾病， 如：破傷風抗毒素血清 抗破傷風， 副作用：超敏反應（2）臨床診斷， 如：肥達氏反應 - 傷寒、副傷寒 缺點：特異性差。第八張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics傳統抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 臟淋巴結B 細胞第九張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnol

5、ogical Pharmaceutics單克隆抗體 monoclonal antibody，McAb1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩定、可大量生產等特點，為抗體制備和應用提供了全新的手段，還促進了基礎和臨床醫學的發展。第十張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第二節 McAb及制備一、 McAb1、McAb定義 是由一個雜交瘤細胞及其后代所產生的針對一個抗原決定簇的高度特異性和專一性的抗體。2、McAb怎樣產生？ 是將抗體產生細胞

6、與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。第十一張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics二、McAb的制備1、抗原與動物免疫 制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。 有的抗原可以用化學合成：地高辛 多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。第十二張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 為使雜交瘤細胞穩定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。 目

7、前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因此免疫動物也采用相應的品系。第十三張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics免疫方法 采用體內免疫法和體外免疫法。 體內免疫法適用于免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用812周齡雌性鼠。 顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細胞進行初次免疫，間隔13周，再追加免疫12次。第十四張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原與福氏完全

8、佐劑等量混合后注入腹腔內，進行初次免疫，間隔24周，再用不加佐劑原抗原追加免疫12次。 一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原，刺激B細胞分裂。第十五張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 脾內免疫法即在麻醉下直接將0.10.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10g。第十六張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 體外免疫法用于不能采用體內免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。 優點：需抗源量少

9、，免疫期短，干擾因素少。第十七張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 體外免疫法：用48周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.55g/ml,在5% CO237 C 下培養45天,再分離脾細胞,進行細胞融合。第十八張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養細胞融合的方法 脾細胞（1108） 骨髓瘤細胞（23107）混合 聚乙二醇誘導下融合，2分鐘，然后用培養液將融合液緩慢稀釋。P25第十九張

10、，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological PharmaceuticsPEG的相對分子質量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%50%，相對分子質量4000為佳。相對分子質量在4006000，濃度在10%60%范圍內的PEG都能使細胞發生融合。為了提高融合率，在PEG 溶液中加入DMSO，以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。第二十張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics用于細胞融合的骨髓瘤細胞應具有融合率高，自身不分泌抗體，

11、所產生的雜交瘤細胞分泌抗體能力強，長期穩定。細胞融合后可產生多種融合 脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細胞如何去除脾-瘤以外的融和細胞？ 選擇性培養 脾-瘤培養基為HAT培養液。 次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻斷DNA合成。第二十一張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第二十二張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics3、篩選陽性克隆與克隆化 篩選陽性克隆常用檢測方法： 免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術等。 克隆化是指單個細胞通過無

12、性繁殖而獲得細胞集團的整個培養過程。第二十三張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。 有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI 1640培養液。 軟瓊脂法：在培養液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養基是半固體狀態，可用吸管吸出，移入96孔板培養。第二十四張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharma

13、ceutics4、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標，了解分泌抗體的能力。 單抗進行Ig類和亞類鑒定： 用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。 親和力、特異性、純度、分子量測定。第二十五張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定染色體分析正常鼠的脾細胞染色體數：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為6268，NS-1為5464，大多數為非整倍性，有中部和亞中部著絲點。 雜交瘤細胞的染色體數目：接近兩親本細胞染色體數目

14、的總和，在結構上多數為端著絲粒染色體外，還應出現少數標志染色體。 染色體數目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；反之，則反。第二十六張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics5、McAb的大量制備體外培養法可獲的10g/ml抗體體內誘生法可獲的 520mg/ml抗體第二十七張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics6、McAb的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內誘生法單克隆抗體的純化方法：（1）澄清和沉淀處理：1000g 離心5min

15、，去除沉淀物（紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質）20 000g 高速離心30min ,去除殘留的小顆粒物質用0.2 m微孔濾膜過濾，去除細菌、支原體飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。第二十八張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics （2）分離A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG 200 作為分離介質，可收集到3個峰，最高峰為IgM，另外兩個峰為 IgG。抗體回收率達5080%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。B、陰粒子交換層析：用于IgG類的分離純化。在p

16、H7.4條件下，IgG1和IgG2能結合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低粒子強度下洗脫下來，其純度很高。 IgG2b和IgG3在低粒子強度下易發生沉淀，可增加粒子強度以提高產量，但其純度相對較低。 C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適用于IgG類。IgG類與蛋白A的結合與pH 有密切的關系。鼠源性單抗在 pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結合在蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 pH3.5緩沖液可洗脫下 IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下 IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a， pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度和很高，但也有極微量的雜蛋白。第二

17、十九張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics癌細胞可培養生長漿細胞B cell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養生長產生專一性抗體一個 B cell 只產生一種抗體第三十張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 一個 B 細胞只能生產一種抗體，對付某一 抗原決定基 若有許多抗原決定基，則需許多株 B 細胞分別生產許多抗體BBBYYYY抗 原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定

18、基第三十一張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開Turn 20第三十二張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics 抗體-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd傳統抗體(抗血清)是所有抗體的混和 脾臟產生各種 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫 抗原采血后可得傳統抗血清已建立之小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集 B 細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月

19、內注射五到八次Ag X第三十三張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics-d細胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤細胞（Subcloning） (確定只有一種細胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌細胞B cell脾細胞分株培養篩選篩選單抗傳統抗體 (抗血清)試驗專一性對抗原的反應無法分辨完全不同d舊有抗原d新的抗原第三十四張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharma

20、ceutics第三節 基因工程抗體 Genetic Engineering AntibodyMcAb具有高度特異性、均一性、又有來源穩定可大量生產等特點，促進了基礎醫學和臨床醫學等眾多學科的發展。 存在的缺陷， McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內有排斥反應；完整抗體分子的相對分子量過大，難以穿透腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。降低McAb的免疫原性；降低McAb的相對分子量。 第三十五張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第三十六張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Phar

21、maceutics第三十七張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics第三十八張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics對鼠源性的McAb進行基因加工和改造目的：降低免疫源性；降低相對分子量方式： 一、人-鼠嵌合抗體 二、改形抗體 三、Fab與Fv抗體 四、scFv 五、單域抗體和分子識別單位第三十九張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics一、人-鼠嵌合抗體 Chimeric Antibodi

22、es人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區與人抗體的恒定區融合而得到的抗體。第四十張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics構建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。構建重組表達載體第四十一張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics克隆鼠單抗的可變區基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術分離。 人抗體恒

23、定區可根據需要選擇，不同的恒定區會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區產生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調整其效應。人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內應用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關抗原)的嵌合抗體。第四十二張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics二、改形抗體 Reshaping Ab（CDR移植抗體）CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體。第四十三張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥

24、Biotechnological Pharmaceutics經過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變，結合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現在已有數百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數是改型抗體）第四十四張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics人源化抗體的構建可用全合成法或定點突變法 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分

25、別退火，然后逐組連接成完整的可變區基因，插入質粒中，進一步即可用于構建和表達改形抗體。第四十五張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics定點突變法是將人的可變區基因克隆，根據鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區基因的CDR序列變為鼠抗體的CDR序列，然后表達出改型抗體。研究表明，在構建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構建時還必需包括對影響抗原結合位點的空間結構的框架序列進行操作。第四十六張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnologi

26、cal Pharmaceutics最小識別單位單域抗體FabFvScFvFab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等都是小分子抗體小分子抗體第四十七張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics三、Fab fragment of antigen binding重鏈VH加CH1和完整的輕鏈組成,大小為完整分子的1/3 把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。第四十八張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics四、 Fv 及 ScFvFv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv（single chain Fv），即單鏈抗體。Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6 FvScFv連接肽第四十九張，PPT共五十六頁，創作于2022年6月抗體制藥Biotechnological Pharmaceutics單鏈