1、 十味益脾顆粒的質量標準提升研究 張鑫 盧新義 馬久太 李百華 韓東 杜疏煬 陳英 劉峰摘 要 目的：為提升十味益脾顆粒的質量標準提供參考。方法：按2015年版中國藥典（四部）通則相關方法，采用顯微鑒別法鑒別六神曲和雞內金藥材，薄層色譜法（TLC）鑒別山楂和萊菔子藥材，高效液相色譜法（HPLC）測定萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽的含量。結果：十味益脾顆粒中六神曲（種皮柵狀細胞和種皮石細胞）和雞內金（不規則碎塊）的顯微特征明顯;山楂、萊菔子藥材與熊果酸、芥子堿硫氰酸鹽對照品和萊菔子對照藥材在相應位置處顯相同的熒光斑點。芥子堿硫氰酸檢測進樣量的線性范圍為23.279 574.42 ng（r=1.000 0

2、），檢測限為0.50 g/mL、定量限為1.68 g/mL;精密度、重復性、中間精密度、穩定性（24 h）試驗的RSD均小于1.5%，平均回收率為99.40%100.89%（RSD為0.18%0.49%，n=3）。3批十味益脾顆粒中芥子堿硫氰酸鹽的含量為0.086 40.220 6 mg/g，平均值為0.168 4 mg/g。結論：成功建立十味益脾顆粒中六神曲、雞內金、山楂、萊菔子藥材的鑒別方法和萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽的含量測定方法;該品含萊菔子以芥子堿硫氰酸鹽（C16H24NO5SCN）計不得少于0.16 mg/g。Key 十味益脾顆粒;山楂;萊菔子;熊果酸;芥子堿硫氰酸鹽;顯微鑒別;薄層鑒

3、別;含量測定;質量標準R284.1 文獻標志碼 A 1001-0408（2020）18-2214-05DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.07ABSTRACT OBJECTIVE： To provide reference for the improvement of quality standards of Shiwei yipi granules. METHODS： According to the general rules of 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part ）， microscopic id

4、entification was used to identify Massa Medicata Fermentata and Galli Gigerii Endothelium Corneum; TLC method was used to qualitatively identify Crataegi Fructus and Semen Raphani; the content of sinapine thiocyanate in Semen Raphani was determined by HPLC. RESULTS： The microscopic characteristics w

5、ere obvious for Massa Medicata Fermentata （palisade cells of testa and stone cells of testa） and Galli Gigerii Endothelium Corneum （irregular fragments）. The same fluorescent spots of Crataegi Fructus and Semen Raphani were displayed at the same position of ursolic acid，sinapine thiocyanate control

6、and Semen Raphani reference substance. The linear range of sinapine thiocyanate was 23.27-9 574.42 ng （r=1.000 0）. The LOD and LOQ were of 0.50 g/mL and 1.68 g/mL， respectively. RSDs of precision， repeatability， intermediate precision and stability tests （24 h） were all less than 1.5%. The average r

7、ecoveries were 99.40%-100.89% （RSDs were 0.18%-0.49%， n=3）. The contents of sinapine thiocyanate in 3 batches of Shiwei yipi granules were 0.086 4-0.220 6 mg/g， the average was 0.168 4 mg/g. CONCLUSIONS： The identification method of Massa Medicata Fermentata， Galli Gigerii Endothelium Corneum， Crata

8、egi Fructus and Semen Raphani in Shiwei yipi granules as well as the method for content determination of sinapine thiocyanate in Semen Raphani are established successfully. The content of Semen Raphani in the Shiwei yipi granules is no less than 0.16 mg/g calculated by sinapine thiocyanate （C16H24NO

9、5SCN）.KEYWORDS Shiwei yipi granules; Crataegi Fructus; Semen Raphani; Ursolic acid; Sinapine thiocyanate; Microscopic identification; TLC; Content determination; Quality standard十味益脾顆粒是山東步長制藥有限公司國家科技重大專項創制新藥，由山藥、雞內金、薏苡仁、蓮子、茯苓、大棗、山楂、六神曲、麥芽和萊菔子組成1。方中山楂、麥芽、雞內金、六神曲均為消食要藥，其中山楂主消肉食并止瀉痢2;麥芽主消米面、諸果食積，且能升發脾胃

10、之氣3;雞內金有消食化石之功效，為消化瘀積之要藥，又善治脾胃之虛弱4;六神曲為行氣調中消食開胃之佳品5，上述四者同為君藥，其余山藥、薏苡仁、蓮子、茯苓、大棗、萊菔子等均為臣藥，諸藥合用共奏補脾益氣、健胃消食之功效1。目前，按原國家食品藥品監督管理局相關標準1，十味益脾顆粒中麥芽通過顯微鑒別進行控制，山藥、蓮子通過薄層色譜（TLC）鑒別進行控制，山楂以熊果酸的含量進行控制。但由于上述質量控制標準過于簡單，難以全面反映和控制十味益脾顆粒的質量。萊菔子作為十味益脾顆粒處方中的臣藥，處方量為165/2 075 g，具有降氣除脹、化痰消食的作用6-7，其主要含有芥子堿、萊菔素、芥酸等成分，其中芥子堿硫氰

11、酸鹽具有降壓、消食除脹、潤腸通便等作用，是萊菔子發揮藥效的關鍵成分8-11。鑒于此，本文在前期研究12-13和現行質量標準的基礎上，Reference方法14-16，建立了十味益脾顆粒中六神曲和雞內金藥材的顯微鑒別法，山楂和萊菔子藥材的TLC鑒別法，萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽含量測定的高效液相色譜法（HPLC），旨在為十味益脾顆粒質量標準的提高和改進提供依據。1 材料1.1 儀器1260型HPLC儀，包括Agilent Chemstation C.01.07 SR2 255色譜工作站（美國Agilent公司）;e2695型HPLC儀（美國Waters公司）;DM3000型生物顯微鏡（德國Leica

12、公司）;SK8200Hp型科導超聲儀（上海五久自動化設備有限公司）;ML204T型萬分之一、XPE205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。1.2 藥品與試劑十味益脾顆粒（山東步長制藥有限公司，批號：190501、181101、180401，規格：每袋裝5 g）;熊果酸對照品（批號：110742-200517，純度：100%）、萊菔子對照藥材（批號：121074-201805，供鑒別使用）、芥子堿硫氰酸鹽對照品（批號：111702-201605，純度：98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈（美國Fisher公司，色譜純）;磷酸二氫鉀（阿法埃莎天津化學有限公

13、司）;硅膠G薄層板（德國Merck公司、青島海洋化工廠、煙臺化學工業研究所）;甲苯、乙酸乙酯、甲醇、環己烷、甲酸、硫酸、乙醇等（國藥集團化學試劑上海有限公司）均為分析純，水為超純水。2 方法與結果2.1 六神曲、雞內金藥材的顯微鑒別取3個批次的十味益脾顆粒，研成粉末，取少許置于載玻片上，使用水合氯醛進行透化，加稀甘油后裝蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，結果見圖1。其中，圖1A為六神曲中的種皮柵狀細胞，胞腔內含淡紅棕色物;圖1B為六神曲中的種皮石細胞，數個相連或單個散在，呈類圓形、貝殼形、類多角形，紋孔甚密，二者可共同作為炒六神曲藥材的專屬性顯微鑒別特征17。圖1C為雞內金中不規則的無色或棕黃色碎塊，

14、其溝紋樣可以作為雞內金藥材的專屬性顯微鑒別特征4。2.2 山楂藥材的TLC鑒別取3個批次的十味益脾顆粒，研成粉末，各取15 g，分別加入乙酸乙酯30 mL，超聲（功率：500 W，頻率：53 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇溶解稀釋制成每1 mL含熊果酸0.2 mg的溶液。取處方量的1/10，按照十味益脾顆粒處方工藝制備模擬陽性樣品和缺山楂藥材的陰性樣品，再按上述供試品溶液制備方法制成模擬陽性樣品溶液和陰性樣品溶液。按照2015年版中國藥典（四部）中TLC法18，吸取上述溶液58 L，分別點于同一硅膠G薄層板上，

15、以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20 4 0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴灑10%硫酸乙醇試液，在105 加熱至斑點顯色清晰，分別置于日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品和模擬陽性樣品在與熊果酸對照品相應位置處顯相同的熒光斑點，且陰性樣品無干擾，詳見圖2。2.3 萊菔子藥材的TLC鑒別取3個批次的十味益脾顆粒，研成粉末，各取10 g，分別加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，再用水飽和的正丁醇振搖萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取萊菔子對照藥材1 g，按上述供試品溶液制

16、備方法制成對照藥材溶液。再取芥子堿硫氰酸鹽對照品，加甲醇溶解稀釋制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取處方量的1/10，按照十味益脾顆粒處方工藝制備模擬陽性樣品和缺萊菔子藥材的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成模擬陽性樣品溶液和陰性樣品溶液。按照2015年版中國藥典（四部）中TLC法18，吸取上述溶液各3 L，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（10 2 3，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品和模擬陽性樣品在與萊菔子對照藥材和芥子堿硫氰酸鹽對照品相應位置處顯相同的熒光斑點，且陰性樣品無干擾，詳見圖3。

17、2.4 萊菔子藥材中芥子堿硫氰酸鹽的含量測定2.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters Xterra-RP C18（250 mm4.6 mm，5 m）;流動相：乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10 90，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：326 nm，柱溫：30 ，進樣量：10 L。2.4.2 系列對照品溶液的制備 稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度分別為2.33、7.76、28.85、86.17、287.23、957.44 g/mL的系列對照品溶液。2.4.3 供試品溶液的制備 取十味益脾顆粒，研成粉末

18、，取約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，取出放涼，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45 m濾膜濾過，即得供試品溶液。2.4.4 陰性樣品溶液的制備 取處方量的1/10，按照十味益脾顆粒處方工藝，制備缺萊菔子藥材的陰性樣品，再按照“2.4.3”項下方法制成陰性樣品溶液。2.4.5 專屬性考察 分別取“2.4.2”“2.4.3”“2.4.4”項下對照品溶液（28.85 g/mL）、供試品溶液（批號：190501）和陰性樣品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，陰性樣品對芥子堿

19、硫氰酸鹽的含量測定無干擾，理論板數按芥子堿硫氰酸鹽峰計不低于8 000，詳見圖4。2.4.6 線性關系、檢測限、定量限考察 精密吸取“2.4.2”項下的系列對照品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。各樣品平行進樣2次。以峰面積的平均值為縱坐標（y）、進樣量為橫坐標（x，ng）進行回歸分析，得回歸方程為y=3.296 2x+22.047（r=1.000 0）。結果顯示，芥子堿硫氰酸鹽檢測進樣量的線性范圍為23.279 574.42 ng。以信噪比3 1得檢測限為0.50 g/mL，以信噪比10 1得定量限為1.68 g/mL。2.4.7 精密度試驗 分別精密吸取質量濃度為2

20、8.85 g/mL的對照品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件重復測定峰面積6次。結果，峰面積的RSD為0.24%（n=6），表明儀器的精密度良好。2.4.8 重復性試驗 精密稱取批號為190501的十味益脾顆粒5.0 g，共6份，按照“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，再按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，芥子堿硫氰酸鹽的平均含量為0.225 8 mg/g，RSD為0.29%（n=6），表明該方法的重復性良好。2.4.9 中間精密度試驗 按“2.4.8”項下方法，由同一實驗室的不同分析人員在不同時間分別制備十味益脾顆粒（批號：190501）供試品

21、溶液6份，并按“2.4.1”項下色譜條件以不同儀器測定其中芥子堿硫氰酸鹽的含量。結果，芥子堿硫氰酸鹽的平均含量為0.221 2 mg/g，RSD為1.15%（n=6），表明該方法的中間精密度良好。2.4.10 穩定性試驗 取“2.4.8”項下的供試品溶液（批號：190501），分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、16、20、24 h時按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芥子堿硫氰酸鹽峰面積的RSD為0.57%（n=9），表明該溶液在24 h內穩定性良好。2.4.11 加樣回收率試驗 精密稱取批號為190501的十味益脾顆粒粉末2.5 g，共9份，置于具塞錐形瓶中，分

22、別精密加入質量濃度為304.73 g/mL的芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液1、2、3 mL，每個量3份，然后按照“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，再按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。2.4.12 系統耐用性考察 取“2.4.3”項下的供試品溶液（批號：190501），按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，分別考察不同檢測波長（324、326、328 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（20、30、40 ）、不同色譜柱（Waters XTERRA? RP、Agilent Eclipse XDB、CAPCELL PAK M

23、G 、Shimadzu Shim-pack GIS和Welch Ultimate? XB-C18）對芥子堿硫氰酸鹽含量的影響。結果，芥子堿硫氰酸鹽含量的RSD分別為0.92%、0.93%、1.05%、1.22%（n=3或n=5），表明該方法耐用性良好。2.4.13 樣品含量測定 取3個批次的十味益脾顆粒樣品，按照“2.4.3”項下方法制成供試品溶液，每批平行制備2份，再按照“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量，結果見表2。3批樣品中芥子堿硫氰酸鹽的平均含量為0.168 4 mg/g。3 討論3.1 顯微鑒別的藥材選擇在十味益脾顆粒的生產工藝中，有3味藥材是經粉碎

24、后入藥，分別是麥芽、六神曲和雞內金，現行標準1中僅對麥芽藥材進行了顯微鑒別。顯微鑒別是中藥粉末的專屬性鑒別方法，具有操作簡單、專屬性強的優點，常用于處方工藝中藥材的粉末鑒別控制，同時也有助于研究者優化其生產工藝，因此筆者在現行質量標準的基礎上增加了六神曲和雞內金藥材的顯微鑒別，從而保證藥品的質量。3.2 TLC鑒別的藥材選擇由于十味益脾顆粒的現行標準1中僅有山藥和蓮子的TLC鑒別，同時除了方中對麥芽進行顯微鑒別以外，其余藥材均未有質量控制的方法，因此本課題組在前期的預試驗中分別對茯苓、薏苡仁、山楂、雞內金、大棗、萊菔子等藥材進行了TLC鑒別考察。結果發現，茯苓、薏苡仁、大棗等藥材的TLC鑒別陰

25、性樣品均有較大的干擾，且無法通過調整展開劑、顯色劑和供試品的制備方法等予以排除，故未列入正文;本課題組只發現山楂、萊菔子藥材的TLC鑒別具有專屬性強、斑點顯色清晰、分離良好的特點，故增加了山楂和萊菔子藥材的TLC鑒別進行質量控制，從而完善十味益脾顆粒的質量標準。3.3 色譜條件的選擇芥子堿硫氰酸鹽是萊菔子藥材中的主要活性成分，具有下氣、降壓和消食的作用，2015年版中國藥典（一部）對其測定主要是采用苯基柱進行測定4。由于苯基柱的適用范圍較窄，且耐用性較差，因此選擇通用的C18柱進行分析測定具有更廣泛的適用性。在色譜條件的選擇時，本課題組分別對流動相的組成及比例進行了考察，曾采用乙腈-3%冰醋酸

26、溶液（15 85，V/V）、甲醇-1%冰醋酸溶液（30 70，V/V）、乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10 90，V/V）進行洗脫。結果發現，以乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10 90，V/V）為流動相時，芥子堿硫氰酸鹽的色譜峰峰形良好且對稱，基線噪音小。同時，還采用正交法對提取溶劑（甲醇、70%甲醇、20%甲醇）、提取時間（20、30、40 min）及超聲功率（150、250、500 W）進行篩選。結果發現，提取時間和超聲功率對芥子堿硫氰酸鹽的測定無顯著影響，而提取溶劑影響較大;最終選擇最優提取條件：75%甲醇作為提取溶劑、超聲功率為500 W、提取時間為30 min

27、。3.4 芥子堿硫氰酸鹽溶劑的選擇2015年版中國藥典（一部）萊菔子項下中芥子堿硫氰酸鹽對照品的溶劑為甲醇4。但是本課題組在前期的預試驗中發現，如果采用甲醇作為提取溶劑，芥子堿硫氰酸鹽對照品會出現雙色譜峰，且有干擾峰出現，推測可能是由于芥子堿硫氰酸鹽存在兩種形式，即芥子堿和硫氰酸鹽形式;也可能是由于對照品溶劑的pH值不同所導致。因此，改用流動相溶解對照品，發現對照品色譜峰峰形改善，無拖尾，無干擾峰出現，因此本文采用流動相作為芥子堿硫氰酸鹽對照品的稀釋溶劑。3.5 萊菔子藥材驗證2015年版中國藥典（一部）萊菔子藥材中規定，按照干燥品計算，含芥子堿以芥子堿硫氰酸鹽計，不得少于0.40%4。取萊菔

28、子藥材按照本文所建立的方法進行測定，結果按干燥品計算，芥子堿硫氰酸鹽的含量為0.432 6%，結果符合中國藥典規定。3.6 限度確定本研究結果表明，3批十味益脾顆粒中芥子堿硫氰酸鹽的含量分別為0.220 6、0.086 4、0.198 1 mg/g，平均含量為0.168 4 mg/g。根據芥子堿硫氰酸鹽轉移率=成藥中芥子堿硫氰酸鹽的含量/（萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽的含量萊菔子的處方量）100%計算得芥子堿硫氰酸鹽的轉移率最低為25.12%，最高為64.14%，平均值為48.95%。為了保證藥品質量，本研究暫將芥子堿硫氰酸鹽的限度定為萊菔子最低含量處方量平均轉移率=0.155 6 mg/g;綜合考

29、慮，十味益脾顆粒含萊菔子以芥子堿硫氰酸鹽（C16H24NO5SCN）計不得少于0.16 mg/g。由于本次研究樣品量偏少，后期會進一步探索研究多批次樣品的含量測定，從而保證限度制定的合理性。綜上所述，本研究成功建立了十味益脾顆粒中六神曲、雞內金、山楂、萊菔子藥材的鑒別方法和萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽的含量測定方法。該品含萊菔子以芥子堿硫氰酸鹽（C16H24NO5SCN）計不得少于0.16 mg/g。Reference 1 國家食品藥品監督管理局.國家藥品標準：YBZ00382008 S.2008-02-04. 2 于蓓蓓，閆雪生，孫丹丹.山楂藥理作用及其機制研究進展J.中南藥學，2015，13（7）：79-82. 3 李毅，