1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 )*:水&化合物的總重量為1kg.名稱質量(X10-3cg)氯化鈉氯化鎂硫酸鈉氯化鈣氯化鉀重碳酸鈉漠化鉀硼酸氯化鍶氟化鈉23.985.0294.011.140.6990.1720.1000.02540.01430.0029?fi waterASW）t人工海水的組成（Lynum and卜旭的昭.1940）如下由MaCI24.477g4.9810gCflCkr H2O1. 1020bKC1(i.6640fiNaHCOj0.1920gKBrSiCl2篇ts水1 O

2、OOrnJ為了避免沉淀的產生，人工海水的各成分需要分別溶解，然后再混合；pH ”.5,可以用濃的氛氧化鈉或鹽酸來調節.用以上人工海水代替天然海水大大方便了實驗室條件下對真菌的培養，使海海洋微生物及其代謝產物-林永成主編2003細菌的分離：牛肉膏蛋白豚瓊脂、營養瓊脂等是分離細菌的常用培養基，前蘇聯細菌學家設計的ZOBELL 2216E培養基是培養好氣性異養細菌較好的培養基，可培養多種細菌，SIMIDU培養基也常 用于海洋好氣性異養細菌的分離，PFENNIGS培養基適用于海洋光合細菌的分離，分離海洋 弧菌可采用TCBS培養基，培養基PH 一般為7.2-7.6,鹽度為28到30,培養溫度28到37,

3、 培養時間1到7天，注意觀察平板菌落變化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小 菌落，為防止真菌的污染，常在培養基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、兩性霉素、 放線菌酮等。放線菌因生長緩慢且菌落不大，一般不會對細菌的分離產生影響。放線菌的分離：1放線菌是數量最多、最常分離到的G+，JENSEN的研究表明，離海岸越近，在0到1米水 深的底泥樣本中，鏈霉菌占分離的放線菌總數的86%，小單抱菌占12%，其他占2%。2 分離培養基多采用合成培養基（高氏合成一號、精氨酸、天門冬素培養基）和有機培養基（HV、YE、WAKSMAN、 bennett）,高氏合成一號是分離的常用培養基，適合尤其是鏈霉菌

4、的生長，但細菌和真菌也 大量生長。HV是以腐植酸為唯一碳、氮源的培養基，對小單抱菌、小雙抱菌、指抱囊菌、 鏈抱囊菌的選擇性高，但是生長的放線菌形態不完整，難以觀察，給挑菌工作帶來困難。3抑制劑放線菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、鏈霉素可抑制細菌，重鉻酸鉀對真菌和細菌均可 抑制，0 - 005%-0 - 01%是較理想的分離抑制劑，有三個特點：抑制細菌和真菌的生長，不影 響放線菌的正常生長，還可促進一些放線菌抱子的萌發，價格低廉。4樣品預處理120干熱處理樣品1小時能大大減少細菌和鏈霉菌的數量，而對稀有放線菌影響較少，甚至能利于抱子萌發，由于海洋樣品多潮濕，同時抱子對濕熱敏感，故采用50到55

5、度的熱處理 會促使大部分抱子萌發?；瘜W殺菌劑法殺菌劑苯酚SDS葡萄糖酸洗必泰CG芐索氯氨BC碳酸鈣氯化鈣富集的放線菌非鏈霉菌屬小單飽菌智囊飽菌小雙飽菌非鏈霉菌屬小四飽菌所有放線菌放線雙飽菌小四飽菌鏈飽囊菌差速離心濃縮真菌的分離：到2000年止已認知的海洋真菌僅僅444種，包括177屬360種的子囊菌（占81 1%），51 屬74種半知菌（占16 - 7%）和7屬10種的擔子菌（占2 - 2%）選擇性富集海水樣品可通過濃縮或過濾，用無菌的045知孔徑的硝酸纖維素濾膜過濾海水，然后直接 把濾膜放在培養基上培養。分離酵母菌時，可將含50-200 mg/L氯霉素的分離培養基用濃鹽酸調PH值至3 4酸性

6、條 件下可抑制很多細菌生長。植物內生真菌分離方法：進行分離前，對植物材料表面進行徹底消毒非常必要，典型的消毒劑有70%-90%的乙醇、漂 白劑、1%的過氧乙酸和3%-30%的過氧化氫，多采用PDA培養基，并加入慶大霉素、氯霉素、 鏈霉素等抗生素，抑制細菌和放線菌的生長。鑒定：16S rRNA相對分子量適中，易于進行序列測定和分析比較，可以為細菌鑒定提供相對穩定 可靠的信息，廣泛用于評價生物遺傳多態性和系統發生關系。18S rRNA成為目前研究真菌 屬物種多樣性的分析比較。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，真核微生物轉錄區包含5S、 18S、 5 - 8S、 28S。（C+G）mol%

7、在種內不超過4%,屬內不超過10%。低于2%沒有分內學意義。只具有否定價值， 需與表型特征相結合。16S rDNA成為細菌種屬鑒定和分類的標準方法，適用種及種以上的分類單位。同源性395%的菌可歸為同一屬，397%可視為同一種，大于97%時必須測定DNA-DNA雜交率 是否大于70%才能確定是否為新種。由于對同種內的不同菌株分辨力較差，更適合研究屬及 屬以上的菌株。18S rDNA普遍用于真菌物種的鑒定分析。植物內生真菌的分離 葉、葉脈、莖、樹皮（韌皮部）等樣品用自來水沖洗掉泥土，然后進行 嚴格的表面消毒程序：依次浸泡在75%酒精lmin，3%一5%有效氯的次氯酸鈉溶液3 min。75%的酒精

8、O. 5min，然后再用無菌水沖洗3遍。晾干后，在超靜臺將其剪成約O. 5cmX0. 5 cm左右小片。將處理好后剪成的小片鋪于PDA平板上，加入氯霉素與鏈霉素各50斗g/mL抑制 細菌的生長，在26培養培養23周分離內生真菌。這些平板在第1周要每天檢查1次，然后 可以3、4d檢查1次。一旦發現有菌絲從組織小塊長出，應馬上將其轉接到另一新的平板上， 經幾次純化保存于PDA斜面。植物組織樣品處理：將采集的紅樹林植物樣品先用流動的清水沖洗干凈，再超聲清洗徹底去 除植物組織表面的雜質，把植物樣品剪切成15 cm左右長度的節段進行表面消毒。樣品依次 用次氯酸鈉（含5%有效氯量）浸泡5 min,無菌水清

9、洗3次，75%酒精浸泡3 min,無菌水清洗3 次，晾干，用粉碎機把植物組織粉碎備L3. 1各種樣品預處理方法樣品懸浮品的直接制直,稱瑕2 g樣品（海生動植物體用無菌剪刀剪碎）到20而的無菌海水中，旋渦振蕩10 mi幾使其充分混懸，法處理樣品6回稱取2 &祥品（海生幼植物體用無菌剪刀5!碎）到20 mL含有0, 05 % SDS JIJ 6 %酵母膏的無菌海水中，振蕩3-5min后，200 rmm 下振蕩 30 min.苯酚法處理樣品（閭：稱取2 &律品（海生動植物體用無菌曲刀曲砰）到含有1. 5 %苯酚的20 mL的無菌海水中*振蕩3-5 min后，3。亳、200 rminT振蕩30 mi

10、n*加熱法處理樣品將直接制備好的樣品懸浮液55C水浴6誡值（或50T2, 1 h）注意:：樣品處理的整個過程必須是天鑿的表1-1菌種分離篩戢所用到的增罪基名稱配方%酵母粉麥牙膏瓊脂(YE) 1121酵母粉。,4,麥芽骨1,葡萄糖0.4,瓊麻2,陳海 水 7M 蒸憎水 25, pH： 7.2-7.4淀粉-干酩素瓊脂(SC)5可洛性淀粉1, 干酪素0.03. KMOi 0.舞，NaCl Oh 2, KjPVi 0.2, MgS 7印。0.00&. CaCOi 0.002. PeSO. 0.001,瓊脂2,放線菌酮 商口伽 陳海水花.蒸慵水舞.pH: 7. 2-7.4葡萄糖-天門黑既氨瓊脂CGA)燦

11、5荀萄摭L 天口窸觥氮口.0瓦 嶙酸氫二鉀0.05, 瓊脂丸 陳海布，蒸憾水25， pH: 7.2-7. 4腐殖酸-艷生素瓊脂HV啊淀粉-蚩白腺瓊脂(Ml)葡萄糖-蛋白腌(Martin) 1，fl|淀粉-黃豆粉漁體發酵培養基 (SLM) 1,41腐殖酸 0, 肱HP& 0.005, KC1 0 17 . 腿S0, 7IS 0. 005. FeSOi 7】S 0.001,CaCQ,0. GQ2 ,醯胺素500 ppm,核黃素25。ppm,肌醇ppm,泛酸5&0田血 對覲基苯酸5DO ppp , 生物案500 ppm,維生素&5Q0 ppn,泛酸500 叩t,煙政500叫m,瓊脂2,陳海水74 蒸

12、慎 未曝 pH:7,2-7. 4可溶性淀粉0,25,景白睡0.酵母粉。05廿油磷酸一.鈉0.01,琉脂幻陳海水7S蒸慌水PH7, 2-7.4菊萄槽L0,蛋白豚0一虱MP0. L0tM純7EW0.05,瓊脂 L pH:T.卜7.4可溶性淀粉L 黃豆粉抽提物1,5,醇母耕【).S, CaCO, 0.4,陳海水75,蒸懦水 23. pM:7. 2-7.4O) HV的配制：稱取腐植酸，加1%的11CL,煮沸后過濾取上清各村雄生素與培養基其 他成分開滅菌.倒皿前加入=以上培養基除GA要求11510下.無菌30 min外，其余培養基詢是1幻1C,火曲 21 mirio加入750 ppm放線菌酮的YE、SC

13、、GA. HV用于涂布預姓理后的樣品；加入100 DM1重鋁酸抑的YE.Gause用于重倍酸鉀選擇法，不加任何抑制劑戒抗生素的YE、5C、GL HV作為對照.不加任何抑制劑或抗生素的YE斜面用來保藏放或菌和真菌.2.22.1分離培養基M16E培養基：Yeast extract1gPeptone5gFePO40.1gAgar2%陳海水配制1000 mLISP3培養基：Oatmeal20 gTrace salt solution1 mLAgar2%蒸德水lOOOmLpH7.2Trace st solution：FeSO7H2O0.1gMnCl2.4H2O01 gZnSO7H2O0.1g去離子水10

14、0 mL察氏培養基；NaNO32gKjHPO*1gKCl0-5 gMgSOq0.5 gFcSOj0.01g庶糖30 EAgar2%蒸悔水1000 mLPH7.2GYM培養基；Glucose4gYeast extractMalt extract10 gAgar2%蒸悔水1000 mLpH7.2兒丁質培養基：K2HPO40.5 gMgSOQH?。02 gFeSO4-7H2O0.01gGlucose（大菌后加入）Wg凡丁質imAgar2%蒸播水lOOOinLpH72HV培養基：腐植酸1 gNa:HPO40火KC1L7gFeSOTHO10 mgMgSO4.7H2O20 gCaO2002 g核黃素0.5

15、 mg肌醇0.5 mg對氨基苯甲酸0.5 mg生物素0.25 mg煙酸0.5 mg泛酸0.5 mg雄生素B60,5 mg硫臏素0-5 mgAgar2%蒸ts水1000 mLpH7.22-2.22純化培養基高氏號培券基；可溶性淀粉20g0.5 gMgSOqH 出0.5 gNaCl0.5 gNaNO31.0 gF?SOjtwig瑜脂2%蒸慵水1000 mLPH7.22.223發酵培養基TSB培養基（上海中科昆蟲生物技術開發有限公司），胰蛋白豚17.0 g大豆蛋白臆3%NaCl5.0 g請萄糖2.5 gKH2PO42.5 蒸帽水1000 mL消前 pH 7.0-72發酵培養基可溶性淀粉20 黃豆餅粉

16、施葡萄新5g酵母提取物Z5gCaCChs gNaCI5g蒸餡水1000 mL叫7+2& 2-4培養基Table 2-4 Culture medium名稱配方HL1培養基將 SJ.Cig fl孕毋氮源 YeastNihogenBase, Difco :- lOOmg Hr 2H I I . 物(Casainiiio acidh Difcn )溶于IL蒸爆水中r過濾除菌再向該溶 轅中加入無圈的崎酸氫二押溶娥.| T:：I： ： 121 U . 20iuin) | A IOOiuL 1.述璃木：宵鬲叫 1 可HL2培養基簡痢勒1口&蛋白騰5聲 期蛋E曲追 Nacl5g.瓊20g. lOOOiuL蒸懈水