1、制藥分離工程-第五章反膠團萃取和雙水相萃取第五章 反膠團萃取與雙水相萃取反膠團萃取雙水相萃取21反膠團萃取技術發展背景：隨著生物工程的發展，傳統的溶劑萃取方法難以應用于一些生物活性物質（如蛋白質）的提取和分離。急需研究和開發易于工業化的、高效的生化物質分離方法。反膠團萃取（reversed micellar extraction)P72頁英文單詞錯誤。反膠團萃取1977年，瑞士學者Luisi等人首次提出用反膠團萃取蛋白質，但并未引起人們的廣泛注意。20世紀80年代，生物學家們才開始認識到反膠團萃取的重要性。反膠團萃取膠團（micelles): 將表面活性劑溶于水中，當其濃度超過臨界膠團濃度時，

2、表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為膠團。水溶液中膠團的非極性基團在內，而極性基團在外。反膠團（reversed micelles): 將表面活性劑溶于有機溶劑中，當其濃度超過臨界膠團濃度時，表面活性劑就會在有機溶液中聚集在一起形成聚集體，稱為反膠團。有機溶液中膠團的非極性基團在外，而極性基團在內。反膠團萃取在反膠團中，極性基團排列在內，形成一個極性核，溶解水后，就形成“水池”，起保護作用，使蛋白質不失活。反膠團萃取常用的表面活性劑：陰離子表面活性劑：丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉陽離子表面活性劑：溴化十六烷基三甲胺，溴化十二烷基二甲胺，氯化三辛基甲胺反膠團萃取丁二酸-2-乙基己基

3、酯磺酸鈉丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉（AOT),最常用，原因：易于獲得具有雙鏈，極性基團小，形成反膠團時，不需要加入助表面活性劑形成的反膠團半徑較大，有利于大分子蛋白的進入反膠團萃取反膠團的形狀和大小反膠團的形狀多為球形或近似球形，有時也呈柱狀結構。半徑：一般10-100nm, 取決于鹽的種類和濃度、溶劑、表面活性劑的種類和濃度以及溫度。W0=水/表面活性劑反膠團萃取水池的性質：水池提供親水微環境，可溶解氨基酸、肽、蛋白質等。當含水率較低時，“水池”內水的理化性質相差懸殊。W0小于6-8時， 池中水的表觀黏度上升50倍，疏水性也極高。由于有較高的電荷濃度，“水池”中水的pH值不同于主體的pH。

4、反膠團萃取反膠團萃取蛋白質的過程：蛋白質進入反膠團溶液是一種協同過程。表面活性劑同臨近蛋白質發生靜電作用而變形-在兩相界面形成反膠團-擴散到有機相中。-改變pH,離子種類、強度等，可使蛋白質由有機相重新返回水相，實現反萃取過程。反膠團萃取蛋白質溶入反膠團的推動力：1.靜電作用力（最直接的因素是pH值,與等電點PI）。2.空間位阻效應（水池的大小和形狀）。反膠團萃取影響反膠團萃取蛋白質的主要因素：與反膠團有關的因素：表面活性劑種類、濃度， 有機溶劑種類，助表面活性劑及其濃度與水相有關的因素：pH值，離子的種類，離子的強度與目標蛋白質有關因素：蛋白質的等電點、大小、濃度、表面電荷分布與環境有關的因

5、素：系統的溫度、壓力雙水相萃取雙水相系統：因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統特點：兩相均含有大量的水（高達80%以上）， 界面張力小，一般只有0.5-10-4mN/m， 萃取環境和條件溫和， 生物相容性好，有時有穩定作用； 分配系數可控：聚合物修飾、相系統組成、 操作條件容易放大，幾百倍。雙水相萃取發展歷史1896年荷蘭微生物學家Berjerinck發現瓊脂水溶液與可溶性淀粉或明膠水溶液混合時形成雙水相現象。1956年瑞典lund大學的Albertsson教授及其同事開始對雙水相系統進行比較系統研究。測定了許多雙水相系統的相圖

6、，考察了蛋白質、核酸、病毒、細胞及細胞顆粒在雙水相中的分配行為，為雙水相萃取系統的發展奠定了基礎。只局限于實驗室內的測定和理論研究。雙水相萃取發展歷史Kula教授研究小組對雙水相的應用、工藝流程、操作參數、工程設備、成本分析等進行了大量研究，在應用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術用于酶的大規模分離純化，建成了一套工業裝置，達到20kg/h的處理能力，分離純化了幾十種酶，也應用于基因工程產品的分離。雙水相萃取可分離多肽、蛋白質、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器、細胞組織，以及重金屬離子等，近年來，還應用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應系統用于酶反應，生物

7、轉化，發酵的產物生產與分離的集成。雙水相萃取1.雙水相系統含較高濃度的水溶性聚合物和鹽，會帶到產物中，去除需要輔助處理方法。2.成本較高。即使水溶性聚合物和鹽盡管回收再用。3.選擇性較低，分離純化倍數低，一般只適用于粗分離。雙水相萃取雙水相萃取1.能夠獲得高的產物回收和生物活性回收，高的分離純化倍數；2.系統的物理化學性質有利于大規模的應用，有良好的工藝性能，系統黏度低，相分離快，達到相平衡時間短，工藝參數容易控制，工藝條件可調性范圍大；3.系統經濟，成本低，無毒，適合大規模應用。選擇雙水相的原則雙水相萃取分配系數 一種物質在兩相系統中的分配行為可用分配系數來描述，分配系數K為該物質在上相和下

8、相中的濃度之比。 此處cT和cB分別為上相和下相中的目的物質濃度。當目的物質主要分配在上相時，分配系數K值大于1，并隨在上相中濃度的增加而增加；反之，目的物質主要分配在下相時，分配系數K值會小于1，并隨在下相濃度的增加而減小。控制能夠影響物質分配系數K的因素，包括環境因素，相系統性質和組成就可以改變物質的分配系數。雙水相萃取 普通雙水相萃取是指主要依靠空間位阻分配和界面電位分配的雙水相萃取，如利用聚合物/聚合物系統和聚合物/鹽系統的萃取，它們發展最早，也是研究最多和應用最多的雙水相系統，也是其它分配萃取系統的基礎。為了改進萃取效率和分離效果，利用控制相系統的pH或在相系統中加入鹽或有機溶劑的方

9、法提高目的物的分配系數。普通的雙水相萃取系統的選擇性比較低，只適用于產物回收和初步分離。雙水相萃取 影響分配的因素表面自由能的影響 分子或顆粒在溶液中的分配，總是選擇到能量最低的哪個相。雙水相萃取 影響分配的因素液體的表面張力大小與液體性質，如溶劑和溶質的性質、濃度、黏度、另一相性質、溫度、壓力等有密切關系，這些因素的變化均造成分配系數K的變化。雙水相萃取在兩相系統中若有鹽存在，會對大分子在兩相中的分配產生較大的影響，通常稱為鹽效應。 鹽濃度對K值的影響雙水相萃取 PEG分子量和KCl對K值的影響雙水相萃取 系統pH的影響相系統的pH不僅直接影響相系統中的蛋白質，也同樣影響系統中鹽，即影響它們

10、解離度和離子的電荷性質及數量，以及各種離子的比例，如H2PO4-和HPO42-，HSO4-和SO42-，NH3和NH4+。進而影響界面電位U2-U1，對蛋白質的分配系數產生強烈的影響。通常pH的微小變化就會引起蛋白質分配系數發生23數量級的變化。雙水相萃取雙水相萃取溫度對分配系數的影響溫度主要影響兩相系統的形成，隨著溫度的降低，分相的臨界聚合物濃度減小，所以在臨界點附近，溫度對酶的分配系數影響較大，而在遠離臨界點時，影響較小；在相組成一定時，溫度的降低會使相圖的結點線增長，兩相差異增大，可引起分配系數的下降。使用PEG/(NH4)2SO4相系統從細菌中萃取熒光素酶時，溫度對分配系數的影響不明顯。雙水相萃取通常酶的穩定性會隨溫度的增高而減低，但在雙水相系統中，由于所使用的聚合物含有多羥基，對酶有保護作用，即使在室溫下，酶的失活也不明顯。因此酶的雙水相萃取可以在室溫下進行，這可以節省因冷卻