1、遺傳變異的物質基礎微生物的基因突變及修復微生物的基因重組菌種的衰退、復壯與保藏 第五章 微生物的遺傳變異與菌種選育 遺傳：微生物通過繁殖，將自己的性狀信息傳遞給 子代，使之在形態、構造、生態和生理生化特 性等方面具有一定的相似性。 一、微生物遺傳變異的物質基礎 （一）遺傳變異的物質基礎 肺炎雙球菌轉化實驗 證實了DNA是生物 噬菌體感染實驗 遺傳物質 煙草花葉病毒的拆開與重建實驗 （部分病毒為RNA） 肺炎雙球菌轉化實驗 證實了DNA是生物 噬菌體感染實驗 遺傳物質 煙草花葉病毒的拆開與重建實驗 （部分病毒為RNA）（1）動物實驗對小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活對小鼠注射活S菌小鼠死亡對小鼠

2、注射活R菌和熱死S菌 小鼠死亡1.經典轉化實驗（肺炎雙球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有莢膜R型菌株：無致病性，菌落表面粗糙，無莢膜（2）細菌培養實驗 熱死S菌不生長 活R 菌長出R菌熱死S菌+活R 菌長出大量R菌和少量S菌以上實驗說明：加熱殺死的S型細菌細胞內可能存在一種轉化物質，它能通過某種方式進入R型細胞并使R型細胞獲得穩定的遺傳性狀.加S菌DNA加S菌的RNA加S菌的蛋白質加S菌的莢膜多糖活R菌R菌S菌只有R菌 只有S型細菌的DNA才能將R型轉化為S型。且DNA純度越高，轉化效率也越高。說明S型菌株轉移給R型菌株的，是遺傳因子。2.噬菌體感染實驗853.植物病毒的拆開與重建實驗

3、 將TMV拆成蛋白質外殼與RNA，分別對煙草進行感染試驗，結果只有RNA能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子。 選用TMV和HRV，分別拆分取得各自的RNA和蛋白質： （1）RNA（TMV） 蛋白質（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白質（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現TMV的典型癥狀并分離到正常TMV粒子（2）表現HRV的典型癥狀并分離到正常HRV粒子。 上述結果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質基礎也是核酸。（二）DNA的結構與復制 的結構 （1）DNA是由兩條反向平行的聚核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤旋形成的右手雙螺旋結構；（2）由磷酸和核苷酸相間組成的主鏈

4、位于螺旋的外側；（3）側鏈堿基位于內側，兩條鏈間的堿基以氫鍵互相配對。 的復制 特點：半保留式復制，確保了 復制的精確性。 過程：雙鏈間氫鍵斷裂 雙螺旋解旋 各自為模板合成互補鏈 氫鍵連接形成新的雙螺旋 基因：生物體內DNA分子上儲存遺傳信息的、有自我復制能力的具有特定的堿基順序的核苷酸片斷。 1.真核微生物 大部分DNA蛋白質 染色體，呈絲狀，存在于細胞核中，極少數DNA存在于細胞器中(線粒體、核糖體) 2.原核微生物 染色體單純由DNA或RNA高度折疊成具有一定空間結構的核區，核區以外的閉合環狀DNA稱為質粒。3.遺傳物質的存在形式 變異：子代與親代或子代與子代之間在形態、構 造、生態和生

5、理生化特性方面總存在差異，凡 能引起遺傳改變的現象稱為變異。 突變：遺傳物質突然發生的可遺傳的變化。 由于重組或附加體等外源遺傳物質的整合而引起的DNA改變，不屬于突變。二、微生物的突變 變種（變株）：發生了基因突變的微生物個體在形態、生理生化或其它方面的性狀發生改變，改變了的性狀可以遺傳。 基因突變 1.按突變涉及的范圍 染色體畸變 （一）突變的類型基因突變：發生在一個基因片段內部，只涉及1對或 幾對堿基對，由于堿基對的替代或增減造成 。 轉換：A-T G-C C-G T-A 堿基對替代 顛換：A-T T-A C-G G-C 堿基對增減：移碼突變正常DNA鏈上的三聯密碼子ABCABCABCA

6、BCABCABCABCABC增添了一個堿基ABCABCAB+CABCABCABCABCAB 缺失了一個堿基AABCBCABCABCABCABCABCABCA 增添了一個堿基 缺失一個BABCABCAB+CABCABCACABCABC 染色體畸變 染色體數目不變，但有較大范圍的結構改變，由DNA（RNA）片段缺失、重復或重排造成。 缺失 重復 倒位 易位同源染色體 homologous chromosomes定義：形態、結構、遺傳組成基本相同和在減數分裂中彼此聯會的一對染色體，一個來自母方，另一個來自父方。一般在同源染色體上有相同的基因座位，因此二倍體細胞中的基因都有兩份。 突變株的表型成因 檢

7、出方法 因突變而喪失合成一補充培養基 營養缺陷型 種或幾種生長因子的 能力不能在基本培養 基上生長突變株 抗性突變型 因突變而產生了對某藥物培養基 種化學藥物或致死 物理因子的抗性 條件致死突變型 突變后在某種條件下 培養條件改變 可正常生長、繁殖并 實現其表型，而在另 一條件下卻無法生長 繁殖的突變型2.按表型改變分 突變株的表型成因 檢出方法 形態突變型 因突變而產生的個體形態 或菌落形態的非選擇 常用顏色變化 性變異 抗原突變型 因突變而引起的抗原 借助于抗原 性發生改變 抗體反應 產量突變型 因突變而獲得的在有 測定產量或 用代謝物產量上高于 其它 原始菌株的突變株 自發突變 誘發突變

8、 自發突變：沒有人工參與，自然條件下發生。 原因：自然界中存在的輻射、環境誘變劑以及 遺傳重組的差錯和DNA的復制差錯。 3.按突變的條件和原因 物理誘變：紫外線、X、 、 射線、 激光、等離子 化學誘變：烷化劑 復合處理及協同效應：同一種誘變劑重復使用 或幾種先后使用。 定向培育和馴化：特定環境，長期處理 誘發突變：物理或化學因素促使細胞DNA分 子結構發生改變、內部堿基配 對發生失誤。 1.自發性： 2.稀有性：10-910-6 3.誘變性：提高突變率10106倍 4.獨立性：各個體突變獨立進行 5.穩定性：突變基因相對穩定， 性狀可穩定遺傳 6.可逆性：（二）基因突變的特點（三）基因突變

9、的機制 * 1.自發突變的機制 自然界中存在的誘變效應：輻射、光、熱 微生物自身代謝產物的誘變效應：咖啡堿、硫氰化合物 堿基的互變異構效應： A:T A:T A:Te G:C G:Te G:Te DNA中堿基錯配、跳格等 堿基對的置換：化學誘變劑 A：烷化劑、亞硝酸等：直接與堿基發生化學反應 B：堿基類似物：肌體缺乏天然堿基時， 直接摻入到DNA分子中 移碼突變：DNA分子中堿基對的增加或減少 2.誘發突變機制 染色體畸變：DNA分子中基因片段的易位、 倒位、缺失、重復，射線、 烷化劑、亞硝酸等 光復活作用 切除修復作用 重組修復作用 緊急呼救修復系統DNA修復損傷機制 三、微生物的基因重組

10、基因重組：遺傳物質從一個微生物細胞向 另一個微生物細胞傳遞,而達到 基因的改變，形成新的遺傳型 個體的過程。 （一）原核生物的基因重組 轉化 轉導 接合 溶源性轉變 一個種或品系的生物吸收來自另一個種或品系生物的遺傳物質,通過交換組合把它整合到自己的基因組中去，從而獲得后者某些遺傳性狀的現象。 1.轉化 轉化過程： 從供體菌中提取DNA片段 與受體細胞結合 DNA片段中的一條鏈降解，另一條侵入 與受體細胞染色體上的同源區段配對 合成雙鏈 染色體復制 細胞分裂 形成轉化子 轉化因子：供體菌的DNA片段 轉化子：轉化后的受體菌 感受態：細胞能從環境中吸收轉化因子的生理狀態。 影響感受態出現的因素：

11、菌種的遺傳特性、生理 狀態、培養環境等。影響轉化效率的因素：受體細胞的感受態受體細胞的限制酶系統和其它核酸酶受體和供體細胞的同源性。 2.轉導 以噬菌體為媒介，把一個菌株的遺傳物質導入另一個菌株，并使該菌株獲得另一菌株的遺傳性狀。 普遍性轉導：噬菌體能傳遞供體菌株的 任何基因。 特異性轉導：噬菌體只能傳遞供體菌株的 某些特定基因。 普遍性轉導過程： 噬菌體侵染供體細胞 供體染色體斷裂，噬菌體蛋白質衣殼和DNA合成 衣殼包裹供體DNA片段 侵染受體菌株 供體DNA片段整合到受體DNA上完全轉導 供體DNA片段不能整合到受體 DNA上，也不能復制，但能表達流產轉導 特異性轉導過程： 噬菌體侵染供體

12、細胞 供體細胞溶源化 噬菌體和供體菌染色體間發生交換 轉導型 噬菌體（轉導顆粒） 侵染受體菌 形成穩定轉導子（取代）形成不穩定轉導子（整合) 供體和受體菌直接接觸傳遞遺傳物質。遺傳類型不同時稱為雜交。 3.接合 F因子：一種質粒，能自我復制。 F-菌株：雌性細菌不含F因子。 F+菌株：F因子游離在染色體之外，為自主復 制的環狀DNA小分子。 Hfr菌株：F因子整合在染色體上，隨染色體一起 復制。（high frequency recombination) F菌株： F因子游離，但帶有一小段細胞核DNA。 雄性細菌 接合過程： F與F： F與F混合、配對 細胞間形成接合管 F菌株F因子的1條鏈斷

13、裂、解旋并進入F 供體細胞內重新合成1條新鏈并形成雙鏈F因子 受體細胞內也合成1條互補鏈并形成F因子雙鏈。 結果： F 變成F F與F：過程同上，結果產生2個F。 Hfr與F-: Hfr與F混合、配對 細胞間形成接合管 Hfr菌株的DNA向F轉移 轉移完全結果產生Hfr轉移不完全結果仍是F- 4.溶源性轉變 由于噬菌體溶源現象，使菌株遺傳性狀發生改變的現象。 與轉導的不同： 噬菌體不攜帶供體的基因，只是把自己的DNA整合到受體菌株。 (二）真核微生物的基因重組1.有性雜交 遺傳性狀不同的2個性細胞相互接合，通過質配、核配、減數分裂，部分染色體發生隨機交換，由此產生重組染色體及新的遺傳型。 有性

14、雜交準性生殖 2.準性生殖： 遺傳性狀有差別的2個同種親本體細胞融合后，不經過減數分裂和接合的交替，不產生有性孢子和特殊的囊器，僅導致低頻率的基因重組。 過程： 菌絲聯結 形成異核體（兩個核） 形成雜合二倍體（兩個核融合） 單倍體化，形成單倍體雜合子（染色體發生交換）。 突變的類型突變的范圍突變的表型突變的原因突變的特點基因重組原核生物：真核生物： 同源染色體 形態、結構、遺傳組成基本相同和在減數分裂中彼此聯會的一對染色體，一個來自母方，另一個來自父方。一般在同源染色體上有相同的基因座位。 同源性并不意味著序列完全相同，兩DNA分子只要含有一段堿基序列大體類似的同源區，即使相互間略有差異，仍然

15、可以發生重組。自然界中工業菌種的篩選微生物的誘變育種微生物的雜交育種原生質體育種利用基因工程技術進行菌種改良四、微生物的菌種選育 （一）自然界工業菌種的篩選程序 1.采樣：土壤、水樣 2.增殖培養：選擇性培養基、選擇性培養條件，設 法增加所要菌種的數量。 3.培養分離：稀釋平板分離、劃線分離等，目的是 確保培養出單菌落。 4.篩選：菌落形態 菌種鑒定 試管斜 面培養 小型發酵試驗 5.毒性試驗：2年以上 （二）微生物的誘變育種 1.出發菌株選擇：對誘變劑敏感、變異幅度廣、產量高 的菌株。 2.同步培養：使菌懸液中細胞達到同步生長狀態 3.單細胞懸液制備：先收集菌體并洗滌，然后用生理鹽 水或緩沖

16、液配制，振蕩使分散度90以上。 4.誘變處理：物理誘變、化學誘變 5.中間培養 ：使細胞內原有酶量稀釋，以得到純的變 異細胞。 6.分離篩選：形態、平皿反應（生理特性）變色圈、透明圈、抑菌圈等營養缺陷型突變體的篩選及應用營養缺陷型：缺乏合成某些營養物質的能力，必須在其基本培養基中加入相應缺陷的營養物質才能正常生長繁殖的變異菌株。基礎培養基：MM完全培養基：CM補充培養基：SM基本步驟： 誘變 淘汰野生型 檢出缺陷型 確定生長譜營養缺陷型菌株的篩選淘汰野生型方法：抗生素法、菌絲過濾法營養缺陷型的檢出方法： 影印法、夾層法、逐個檢出法、補充培養法等確定生長譜：確定其缺陷因子 方法：不同組合的營養混

17、合物與MM培養基鋪成平皿后分離。營養缺陷型菌株的應用微生物分析法：定量分析各種生長因素，分析食品中氨基酸和維生素的含量作為研究微生物經轉化、轉導、接合、雜交育種的標記（三）微生物的雜交育種 將兩個基因型不同的菌株的細胞互相聯合、細胞核融合、減數分裂，遺傳性狀會出現分離和重新組合，產生具有新性狀的重組體，然后經分離和篩選，獲得符合要求的生產菌株。 由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種，因此無論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進了一步。 （四）原生質體育種 主要技術：原生質體融合、原生質體轉化、 原生質體誘變 原生質體融合的步驟： 原生質體制備 融合 再生培養 選擇性培養基上劃線培養

18、分離驗證 生產性能篩選基因工程技術：將含目的基因的DNA片斷經體外操作與載體連接，轉入受體細胞并使之擴增、表達的過程。 （五）利用基因工程技術進行菌種改良步驟： 1.目的基因的獲得 2.載體的選擇 3.目的基因與載體連接，構成重組載體 4.將重組載體引入受體細胞 5.篩選帶有目的基因的轉化細胞 6.鑒定外源基因的表達產物 1.微生物菌種的保藏 微生物生長的條件：溫度、水分、氧氣、 營養、pH、滲透壓等。 微生物保藏的原理： 采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加酸度中和劑等方法，使微生物生長代謝受到抑制。 五、微生物菌種的保藏及復壯 A：蒸餾水懸浮法：保存時間較短 B：斜面傳代保藏法：實驗室用，46保藏， 每36個月轉接1次。 C：礦物油浸沒法：隔絕空氣 D：干