1、 單克隆抗體制備技術 2008年11月6日雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理1：HAT選擇培養基： 次黃嘌呤(hypoxanthine,H) 氨基蝶呤(aminopterin,A) 胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).2：細胞的DNA合成一般有兩條途徑：A：由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與反應。B：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理HAT培養基的選擇原理：A：氨基蝶呤(A)是葉酸拮抗劑，可阻斷細

2、胞利用正常途徑合成DNA，細胞在含有氨基蝶呤的培養基中不能通過正常途徑合成DNA。B：瘤細胞是HGPRT酶陰性細胞，自身不能通過替代途徑合成DNA而繁殖。C：B細胞雖含有HGPRT，但不能在體外培養存活（只存活57d，且功能下降)。D：融合細胞含有B細胞和瘤細胞，其中瘤細胞核利用B細胞的HGPRT酶進行旁路合成DNA而存活。免疫程序與檢測方法的建立o免疫程序o建立檢測方法o檢測免疫效果免疫程序免疫程序 取6-8周齡BalbC雌鼠，首免，每只鼠用0.5 mL含50 g的重組蛋白與10 % 體積的ISA15A VG 佐劑混勻，頸背部皮下多點注射；間隔3 w進行二免，免疫原、劑量和方法同上；再間隔2

3、 w進行三免，免疫原不含佐劑，腹腔注射，劑量同上。細胞融合前3 d加強免疫，腹腔注射0.5 mL含50-100 g純化的蛋白。 3-5天后用于融合。 免疫程序免疫程序 免疫時是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強弱有關，以IgG為例，第一次為100g，第二次為50g，免疫途徑第一次可經腹腔注射。對于細胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06-1107。檢測方法的建立及免疫效果的評價A：建立成熟的檢測方法是關鍵，一般有以下幾種方法： ELISA IPMA 免疫熒光B：免疫效果的評價 一般于三免疫后一周，通過尾靜脈采血檢測抗體產生情

4、況，一般以稀釋1000倍仍為陽性判為免疫成功。雜交瘤細胞株的建立o SP2/0細胞的準備 o 飼養層細胞的制備o 免疫脾細胞的制備o 融合 o 陽性雜交瘤的篩選 o 細胞的凍存與復蘇o 單克隆抗體的制備 SP2/0細胞的準備o SP2/0細胞在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養基作適應培養，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。o 融合前24-48 h將SP2/0細胞分瓶擴大培養，融合前6 h，棄去瓶中培養液，換上新液。o 融合時，選擇形態良好、呈對數生長的SP2/0細胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于15 mL離心管內，1000 rpm離心5 min，用5 mL無血清的1640懸浮沉淀，再離心一次

5、，然后用無血清的1640培養液重新懸浮，細胞計數，取107細胞懸液備用。 飼養層細胞的制備o融合前一天制備飼養細胞，一般選用8周齡Balb/C小鼠腹腔巨噬細胞，步驟如下：1.將Balb/C小鼠摘除眼球采血（留做陰性對照），然后拉頸處死，浸泡在75%酒精內，5min。2.用無菌剪刀剪開皮膚，用無菌鑷子撕開皮膚，暴露腹膜。3.用5mL無菌注射器吸取5mL HAT選擇培養液注入到小鼠腹腔中（嚴禁刺破腸管），注射器不拔出，然后用無菌鑷子輕輕觸動幾次左右兩側腹膜，吸出營養液。4.重復1次上步操作，補足20mL HAT選擇培養液，混勻后加入2塊96孔板，100L/孔，放入37 CO2培養箱培養。（此為經驗

6、操作，標準操作要進行細胞計數，濃度為1105/mL；如果做2塊飼養細胞，吹兩次即可，如果做3塊則加吹一次）免疫脾細胞的制備o加強免疫3-5天后小鼠眼球采血（作為陽性對照，盡量多的采血，否則脾中紅細胞較多，影響融合），然后拉頸處死，浸泡在75%酒精內，5min。o用無菌剪刀剪開皮膚，無菌鑷子撕開皮膚，暴露腹膜；再用無菌剪刀剪開腹膜，暴露脾臟；無菌取脾臟，無血清1640洗一次，去除結締組織；無菌注射器吸取1640培養液，將脾細胞吹出；1000rpm離心5min，細胞用1640培養液洗1次，細胞計數，取5107-1108脾細胞懸液備用。 融 合o將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10-1：5的比例混合在一起

7、，在15mL離心管中用無血清1640洗1次，離心，1000rpm,5min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響PEG濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。o60s內加入37預溫的1mL 50%PEG溶液，邊加邊輕微搖動。37水浴靜置作用90s。o加37預溫的1640培養液以終止PEG作用，首先，1 min加入1 mL，然后在5 min內緩慢加入10mL，終止后置于37作用5min。o離心，800rpm, 5min。o棄上清，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動，用40mL含HAT選擇培養液輕輕重懸。o將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100L。一般一個免疫脾臟可接種4-6塊

8、96孔板。o將培養板置37、5%CO2培養箱中培養。 培養天數培養天數 脾細胞脾細胞 骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞 飼養細胞飼養細胞 雜交瘤細胞雜交瘤細胞 0 良好良好 良好良好 良好良好 可見融合細胞可見融合細胞 1-2 開始死亡開始死亡 銳減銳減 良好良好 成成2-3個亮細胞個亮細胞 3-4 大部死亡大部死亡 幾乎完全死亡幾乎完全死亡 良好良好 成簇成簇3-5，10個細胞個細胞 5-7 死亡死亡 死亡死亡 變形變形 100個左右細胞呈小島個左右細胞呈小島 7-14 死亡死亡 死亡死亡 變形變形 1/3-1/5孔底面積孔底面積融合后各種細胞的情況換液換液：融合之后5d換液，吸出150L，加入200

9、L HT營養液。融合過程中注意事項o SP2/0細胞與免疫脾細胞數比例適當。o 兩種細胞要處于較好的狀態，吹吸細胞時要輕柔。o PEG融合之后，加營養液中和時要緩慢，以免將破壞融合細胞。陽性雜交瘤的篩選o 雜交瘤細胞長到孔底1/5-1/10時可以進行檢測，一般情況下10d即可；還可以當營養液發黃時檢測。o 取樣：無菌取雜交瘤培養上清，然后在原孔中加入HT培養液。o 應用已經建立起的檢測方法篩選陽性孔，以制備PCV2-Cap單抗為例： 用重組PCV2-Cap蛋白和野生型桿狀病毒包被ELISA板進行平行檢測，每孔加入50L雜交瘤細胞培養上清液（如果同時檢測項目繁多，可以統一稀釋2-5倍進行檢測）。

10、重組PCV2-Cap蛋白檢測為陽性而野生型桿狀病毒為陰性的的雜交瘤細胞轉入24孔板進行擴大培養（HT培養液）， 長至80%單層時再檢測一次，如果仍然為陽性則立即進行進行亞克隆。陽性雜交瘤的篩選過程中注意事項o 檢測雜交瘤細胞的時機很重要，早了抗體產生量少，不易檢出；晚了細胞死亡較多，不利于后續培養及亞克隆。o 從96孔板中取樣品之后應立即補上HT培養液，利于細胞保持較好的狀態。o 取樣時做好標記，以免造成錯誤。雜交瘤細胞的亞克隆原則o 對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果

11、會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。雜交瘤細胞的亞克隆的方法o 24孔中細胞生長狀態良好的雜交瘤細胞可以進行亞克隆，將細胞用營養液吹起，適當稀釋后進行細胞計數，取100個細胞加入到20mL含20% FBS營養液中，混勻后加到96孔板中，200L/孔。也可以亞克隆前一天制備飼養層細胞，再進行亞克隆。當細胞長至孔底1/5-1/10時（大約10天）進行檢測，將具有單個克隆的陽性細胞孔繼續進行第二次亞克隆，當亞克隆之后檢測到每個雜交瘤細胞孔都為陽性為止，一般要經過3次亞克隆。亞克隆過程中注意事項o 亞克隆之前可

12、以制備飼養層細胞，促進雜交瘤細胞生長；如果細胞狀態好，也可以不用飼養層細胞。o 在細胞計數前應該將雜交瘤細胞做適當的稀釋，稀釋倍數根據細胞量而定，10-100倍不等。細胞計數時將細胞控制在2-10104/mL，這樣計數時即快又準。o 第一次亞克隆時，為了確保成功，可以取200個細胞進行亞克隆。o 如果細胞生長不良，可以中途換液，把細胞吹散。細胞的凍存與復蘇o 單抗的制備是一個較長的過程，中途可能會發生污染而前功盡棄，所以要及時進行細胞的凍存：各個時期的陽性孔雜交瘤細胞都要凍存。 將生長狀態良好的細胞吹起后，1000rpm離心5min，棄上清，用凍存液將細胞重懸，之后凍存，程序如下：4 放置1h

13、，-20 放置4h，-80 過夜，然后置液氮中保存。o 細胞的復蘇：從液氮中取出細胞，迅速置于37 水浴鍋中迅速融化細胞，營養液稀釋后1000rpm離心5min，棄上清，用營養液將細胞重懸之后常規培養。單克隆抗體的制備o 培養上清法 將陽性雜交瘤擴大培養，直到細胞全部死亡，收集培養液凍存備用，該法單抗含量少。o 腹水的制備常規是先腹腔注射0.5mL Pristane (降植烷) 或液體石臘于BaLbc鼠，1周后腹腔注射1106個雜交瘤細胞，接種細胞710天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110

14、mL腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。單克隆抗體的鑒定o 抗體特異性的鑒定 o McAb的Ig類與亞類的鑒定 o Western-blot分析 o McAb中和活性的鑒定 o McAb識別抗原表位的鑒定 o McAb親和力的鑒定 抗體特異性的鑒定o除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA、IPMA等法。McAb的Ig類與亞類的鑒定o 采用商品化的亞類鑒定試劑盒進行。Western-blo

15、t分析o 以抗PCV2 的單抗為例：取純化的PCV2病毒進行SDS-PAGE分析，然后將其轉印到硝酸纖維素膜（NC）上，與篩選到的5株單抗進行Western-blot，以SP2/0培養上清作為對照，HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)為二抗，用3，3-二氨基聯苯胺（DAB）底物溶液顯色、拍照。McAb中和活性的鑒定o 以抗PCV2單抗為例，用固定病毒稀釋抗體的方法進行病毒中和試驗用于檢測單抗的中和活性。將雜交瘤細胞培養上清液和腹水按 1: 2系列稀釋，分別與含有 200 個TCID50 的 PCV2/LG 株等體積混合，置37 感作3 h；同設 PCV2 陽性血清、SP2/

16、0 細胞培養上清作為陽性和陰性對照。病毒接種細胞培養至72 h，固定細胞，用 PCV2 陽性血清進行IPMA檢測各孔病毒抗原反應，將能夠抑制50 %病毒增殖的抗體最高稀釋倍數定為抗體中和效價。 McAb識別抗原表位的鑒定o 采用間接ELISA法相加試驗，計算相加指數（AI）來分析單抗決定簇，具體做法如下： 在包被好抗原的ELISA板中分別加入各種單抗（均為稀釋5倍）各100L，以及各單抗兩兩組合各50 L，37孵育1 h，后序步驟與常規ELISA相同。根據下列公式計算AI，A1，A2分別為各株單抗的A值，A1+2為兩兩組合的混合單抗的A值。AI 大于10%表示兩株單抗針對不同抗原表位，具有相加效應； AI小于10%則表示兩株單抗針對抗原表位相同或相近。AI= （A1+2- A1）/ A2100%McAb相對親和力的鑒定o 采用ELISA法，用抗原包被ELISA板，一抗為不同稀釋度的單抗，二抗為羊抗鼠IgG，ABTS顯色后測定A值。再以單抗的濃度的濃度為橫坐標，以其相應的A值為縱坐標，繪制標準曲線。從標準曲線上根據直線中點對應的各株單抗的濃度，即可求出各株單抗的相對親和力。溶液的配制o HAT選擇培養液： 76 mL 1640營養液 20 mL FBS（PAA） 2 mL HAT（Sigma，50X） 2 mL 5.6%碳酸氫鈉溶液 100