1、1. 激光共聚焦掃描顯微鏡有什么特點？1光源：用激光做光源，從理論上消除了色差。因為激光的單色性強、光源波束集中、波長相同。2共聚焦技術：在物鏡的焦平面上放置了一個小孔，將焦平面以外的雜散光擋住。3點掃描技術：共聚焦顯微鏡：將樣品分解成二維或三維空間上的無數點，用十分細小的激光束點光源逐點逐行掃瞄、成像，通過計算機軟件組合，最后得到一個整體平面的或立體的像。也就是通過精細平面光切，形成生物樣品不同平面的精細圖象，將一個連續的光切圖象Z Z 軸重疊就可形成一個完整的三維圖象普通光鏡：是在可見光源下一次性成像。4信號放大、電子圖像：光電倍增管放大信號，計算機采集和處理光信號。5軟件：計算機代替了人

2、眼或照相機進行觀察、攝像，得到的圖象是數字化的，可以在電腦中進行處理，再一次提高圖象的清晰度。 優勢：在結構方面：激光做光源，光色純，波長固定，成像效果好，分辨率高，圖象清晰，熒光檢測信噪比高，可實現分層掃描，可實現連續掃描，可動態記錄變化，可多根激光管同時掃描，多色熒光同時成像，掃描速度快，對樣品損傷小。 在效果方面：更靈敏：共聚焦顯微鏡采用了光電倍增技術，可將很微弱的熒光信號放大。只要有信號就能被檢測到。定位更精確：不僅可以定位到細胞水平，還可以定位到亞細胞水平、和分子水平。這也是熒光標記的抗體被稱為分子探針的原因。 定量測量。靜態的定量測量：對于不同組的樣品，可以單純比擬一種成分，也可以

3、同時比擬兩種甚至三種成分。也可以在同一張切片上比擬不同成分含量。動態的定量測量：共聚焦顯微鏡還能對活細胞內的特定成分如：鈣、鈉、氫等進行動態變化測量，并給出動態變化曲線；還可以同時測量幾種成分，并給出含量比值。 快速性：由于利用光源光束點掃描，檢測過程快，時間短，計算機精確控制激發光強度，光漂白和熒光淬滅作用很小。 數據圖像可及時輸出或長期儲存：用計算機代替了普通的照相機，得到的圖像是數字化的，不存在暴光方面及膠卷沖洗方面的問題如熒光太弱，無法暴光；或曝光過程中熒光淬滅等；而且圖像可進一步加工處理。2. 與靜態細胞觀察相比，活細胞觀察有哪些優勢？ 活細胞動態觀察靜態成像科研角度能夠連續觀察細胞

4、及分子水平的動態變化，說明機制，更能說明問題需要大量樣品、時間點，樣品的差異化問題，出現假陽性結果應用范圍既能滿足高分辨，又能夠滿足實踐分辨要求較高的實驗無法做時間分辨比擬高的實驗，以及對細胞或分子實時動態三維觀察實驗過程實驗簡單化，操作步驟少，數據信息充足實驗設計復雜，步驟多，數據信息少3. 綠色熒光蛋白如何發出綠色熒光？水母體中有一種發光蛋白Aequorin，它與鈣離子結合時會發出藍光，這道藍光立刻被一種蛋白吸收從而發出綠色熒光，這種捕獲藍光、發出綠光的蛋白質就是GFP。GFP生色團： Ser 65- - Tyr 66- - Gly 67，GFP中絲氨酸65展開多肽骨架 環化 形成咪唑啉酮

5、環系統形成 通過脫氫反響-H2O 形成 環化環系統 在經過 氧化反響+O2 形成成熟綠色熒光發色基團，發綠色熒光。熒光的發光是被一定波長光激發后，電子被激發到高能級，隨后向低能級躍遷的過程中發出比激發光波長更長的熒光，這也就是上面提到的受激輻射。我們將能接受光輻射，并躍遷發出顏色光的基團叫做生色團。綠色熒光蛋白含有一個三肽的單位Ser65-Tyr66-Gly67，在蛋白質折疊的時候，這三個氨基酸會折疊成5元環的咪唑酮的結構，也就是生色團。當它被激發后，失去一個質子，形成了帶負電荷的結構，在這種構象下就可以發光了。4. 與傳統的熒光素相比，綠色熒光蛋白應用于蛋白質的熒光標記時有哪些優缺點？5.

6、與熒光素酶相比，綠色熒光蛋白作為報告基因有哪些優缺點？6. 舉例說明綠色熒光蛋白可以應用于哪些方面？（1） 報告基因：可以監控細胞內活動；可以進行細胞篩選FACS：例如，可以在胚胎或成體復雜的組織中別離得到表達熒光蛋白的活細胞，通過熒光激活細胞分選，我們可以通過解剖別離含有目的的熒光蛋白的組織，然后酶消化成單個細胞，流式分選出表達目的的熒光蛋白的活細胞；還可用作蛋白質定位，如果蛋白質進入那么顏色會疊加；可用來觀測基因的表達水平。（2） 轉基因動物：主要是GFP在腫瘤研究中的應用，例如可以通過熒光的強弱判斷腫瘤的大小與深度，內部的腫瘤所發出的熒光由于受周圍組織，尤其是皮膚的干擾，小的瘤灶常難以顯

7、示，因此我們可以在欲檢測的器官做一個可逆性的皮瓣，觀察時翻開皮瓣，建立熒光通路。（3） 傳感器：檢測細內PH，綠色熒光蛋白可以激活FP，轉換FP，開關FP。光漂白恢復：光漂白 photo bleaching 指在光的照射下熒光物質所激發出來的熒光強度隨著時間推移逐步減弱乃至消失的現象。借助于高強度激光來照射細胞某一區域，造成該區域熒光分子的光淬滅即漂白，該區域周圍的非淬滅熒光分子會以一定的速率向受照射區域擴散，這個擴散速率可通過低強度激光掃描探測，因而可得到活細胞的動力學參數。7. 為什么說“蛋白質藥物開發是獨一無二的挑戰？蛋白質分子與小分子物質穩定性比擬蛋白質小分子大量潛在的反響位點很少反響

8、位點大量離子化位點很少離子化位點有二級、三級、四級高級結構沒有高級結構溫度效應是間斷的變性溫度效應是連續的易支撐微生物生長8. 常用的包涵體復性方法有哪些？有何優缺點？常用方法：稀釋法，透析法，超濾法，液相色譜法優點：復性條件比擬溫和、層析介質的隔離降低了蛋白相互作用產生的聚集；可同時實現蛋白質的復興和純化，耗時少；回收率高、快速、易放大、樣品稀釋倍數小一般5倍左右缺點：很難防止在交換溶液時變性蛋白聚體形成少量沉淀，并且吸附在凝膠介質，造成復性率和柱子載樣量降低9. 藥用重組蛋白生產過程中需要檢測哪些工程？要使用哪些方法來檢測？檢測工程檢測方法產品是否含內毒素家兔熱原法蛋白質是否變異肽譜、HP

9、LC、等電聚焦、毛細管電泳甲硫氨酸是否被甲酰化肽譜、質譜、HPLC、Edman分析蛋白質是否變形、聚合、脫氨基SDS-PAGEA、凝膠層分析、等電聚焦、質譜、HPLC、毛細管電泳、Edman分析是否含DNADNA點印跡雜交氨基酸是否發生取代氨基酸分析、肽譜、質譜、毛細管電泳產品是否被細菌、病毒、支原體等污染微生物學檢測10. 列出糖蛋白的分析路線。11. 與非重組蛋白相比，重組蛋白在特性描述方面有何特別之處？ 12. 藥用蛋白制備過程中必須去除的3種特殊物質是什么？如何去除？DNA、熱源和病毒是蛋白質純化過程中尤其需要重視的3種潛在的非蛋白質雜質。DNA：每劑藥用蛋白中DNA含量<10

10、pg,接受治療的病人沒有被誘發腫瘤的危險。 DNA (pH>4. 0時) 是一個強陰離子分子，可在適宜的條件下吸附到陰離子交換色譜上，利用此特點可去除DNA。 DNA 不會吸附于親和色譜柱和疏水色譜柱，因此利用此特點也可去除DNA。熱源：注射用藥用蛋白要求最終到達無熱源狀態，否那么會引起被注射者發燒、發冷、改變血管滲透性或其他副作用，這種反響為熱源反響，生化或藥用產品中任何引起該種反響的組分被稱為熱源。最主要的熱源污染物來源于腸細菌族的內毒素，它們是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分為脂多糖，該種多糖在細胞生長或溶胞時被釋放而且非常穩定， 即使在高壓消毒后仍有生物活性。傳統的除熱源方法通常有兩種

11、：通過化學或熱處理使其無活性；采用活性炭、石棉、亞硫酸鋇等介質吸附。最優化的和最有效的方法是使用色譜法從蛋白質溶液中去除熱源。脂多糖是陰離子分子，從而可以用陰離子交換色譜方法除去，也可使用相應的親和色譜法去除。病毒：終產品中的病毒污染物主要來源于宿主細胞中的內生病毒，因此，充分地對母細胞庫進行病毒篩選和檢測便顯得尤為重要。在細胞株被用于生產前，主細胞庫應該是無病毒的，這將徹底減少最終純化產品中病毒污染的危險。實際上，大多數情況下，為獲得產品的理想蛋白純度而設計的正常層析方案應該能除去最終產品中的病毒污染物，然而在純化過程中，推薦使用專門的有效的方法，如過濾、UV失活(除去或使病毒失活)等，即使

12、這些步驟不能提高產品的產量和純度，為了產品的平安性，在純化過程中應該將這些步驟結合起來。13. 蛋白質作為藥物的缺陷有哪些？（1） 常穩定性差，體內易降解（2） 半衰期短，需要長期頻繁給藥（3） 分子量大，易產生免疫原性（4） 相對分子量較大，難以透過生物膜（5） 給藥途徑單一，注射用溶液劑和凍干粉針14. 與傳統藥物相比，納米藥物有哪些優勢？（1） 納米藥物載體可以進入毛細血管，在血液循環系統自由流動，還可以穿過細胞，被組織與細胞胞飲的方式吸收，提高生物利用率（2） 納米載體的比外表積高，水溶性差的藥物在納米載體中的溶解度相對增強，克服無法通過常規方法制劑的難題（3） 納米載體經特殊加工后可

13、以制成靶向定位系統，如磁性載藥納米顆粒。可降低藥物劑量減輕副作用。（4） 延長藥物的體內半衰期，藉由控制聚合物在體內的降解速度，能使半衰期短的藥物維持一定水平，可改善療效及降低副作用，減少患者服藥次數。（5） 可消除特殊生物屏障對藥物作用的限制，如血腦屏障、血眼屏障及細胞生物膜屏障等，納米載體微粒可以穿過這些屏障部位進行治療（6） 口服胰島素納米囊可保護胰島素不被酶破壞，提高胰島素的降糖作用。（7） 皮下注射胰島素納米囊，降糖作用可持續7天，3天1次給藥的降糖作用可接近1天3次給藥的常規胰島素治療效果，并減小血藥濃度的波動。（8） 作為控制劑的聚乳酸藥效實踐，實驗最長已經到達200天，一般也可

14、以到1-2個月15. 什么是EPR效應？納米藥物靶向技術中的物理化學導向和生物導向指的是什么？EPR效應：即是癌細胞會分泌比正常細胞多的vascular permeability factor，造成腫瘤組織附近血管比起正常的血管物質滲透性高，因此分子體積大的高分子化合物更能滲透、經過癌組織。加上癌細胞破壞淋巴系統，造成高分子化合物停留在腫瘤組織附近時間較長的現象。物理化學導向：利用藥物載體的PH敏、熱敏、磁性等特點在外部環境的作用下如外加磁場對腫瘤組織實行靶向給藥。生物導向：利用抗體、細胞膜外表受體或特定基因片段的專一性作用，將配位子結合在載體上，與通過特異性結合，使藥物能夠準確送到腫瘤細胞中

15、。16. 納米物質生物效應機制研究的內容有哪些？（1） 確定納米顆粒在體內的吸收、分布、代謝和去除的生物學途徑；（2） 各種形態納米物質與生物器官細胞/分子相互作用的方式；（3） 不同納米材料可能的靶器官或生物標志等；（4） 納米材料的急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性等；（5） 新的實驗方法學如熒光檢測法。17. 哪些方法可以實現蛋白質的靶向性？這些方法各有哪些優缺點？試設計實驗方案加以證明。18. 歸納整理出案例“Sustained gastrointestinal activity of dendronized polymerenzyme conjugates詳細的技術路線。四種多聚物分別修

16、飾得到的修飾酶在胃中的表現行為有何不同？為什么？題目：樹枝狀聚合物 - 酶綴合物的胃腸活性持續目的：改善口服酶PEPs在胃腸中的穩定性和活性。¢ 方法：共價交聯多聚物內容：1. 制備酶-多聚物交聯物2. PG1 和 PDL 在體外和體內粘膜吸附能力表征3. MX 和 MX-多聚物在體外模擬胃腸條件下的穩定性和活性4. 活體檢測 MX 和 MX-多聚物的胃腸活性5. MX- PG1在胃里的 穩定性6. 通用性摘要：穩定和保持胃腸道中酶活性的方法很少被研究，因為保護蛋白質免受已經進化以促進其消化的環境的困難。然而，在這些條件下阻止酶的降解對于開發新的基于蛋白質的口服療法是至關重要的。在這

17、里我們顯示共價結合到聚合物可以穩定在胃腸道不同位置的口服治療酶。建筑上和功能上不同的聚合物被用來保護酶的空間失活，并促進與胃壁粘蛋白的相互作用。使用這種方法，酶的體內活性可以在胃和/或小腸中持續幾個小時。這些發現為基于口服蛋白質的新的治療和成像策略的開發提供了新的見解和堅實的根底，使用簡單易行的技術。19. 歸納整理出案例“Preparation of chitosan-based multifunctional nanocarriers overcoming multiple barriers for oral delivery of insulin中納米顆粒的設計方案，各組分的作用是什么？

18、作者如何驗證納米顆粒的效果? 題目：基于多功能納米載體克服多重障礙的口服胰島素殼聚糖的制備各組分作用：殼聚糖與聚陰離子的相互作用導致在水性介質中和溫和條件下自發形成納米顆粒，不需要使用有機溶劑或加熱，防止細胞毒性問題和對胰島素穩定性的威脅。LV，L-纈氨酸，用作促進小腸吸收的靶配體PBA，L-纈氨酸修飾的殼聚糖在納米粒子中對蛋白質藥物的包封率高，藥物吸收增強，藥物在腸道中滯留時間延長以及有利的酶促抑制作用等都有很大的奉獻。L-纈氨酸結合的藥物增強了藥物的口服生物利用度，L-纈氨酸結合的載體在吸收藥物中的巨大潛力。苯基硼酸，疏水和葡萄糖敏感單元，從合成組分中引入替代的葡萄糖傳感器局部苯基硼酸作為這樣的目標的潛在候選者，這是由于硼酸可逆地與二醇結合形成環狀硼酸酯在水介質中如何驗證：通過