1、模塊四、酶的固定化模塊四、酶的固定化酶制劑生產技術酶制劑生產技術生物化工學院生物化工學院 楊芳楊芳固定化生物技術固定化生物技術 通過化學或物理的手段將酶或游離細胞定通過化學或物理的手段將酶或游離細胞定位于限定的空間區域內，使其保持活性并可位于限定的空間區域內，使其保持活性并可反復利用。反復利用。 引入引入學習情境十四學習情境十四 酶的固定化酶的固定化工作任務（一）固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）固定化技術和固定化酶概述工作任務（二）酶的固定化技術工作任務（二）酶的固定化技術工作任務（三）固定化酶的特點工作任務（三）固定化酶的特點工作任務（四）固定化酶的應用工作任務（四）固定化酶的應用水溶

2、性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術固定化技術工作任務（一）固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）固定化技術和固定化酶概述固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme) 固定在載體上并在一定空間范圍內進行固定在載體上并在一定空間范圍內進行催化反應的酶。催化反應的酶。固定化技術和固定化酶概述固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）工作任務（一）固定化技術和固定化酶概固定化技術和固定化酶概固定化技術和固定化酶概述固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）工作任務（一）固定化技術和固定化酶概固定化技術和

3、固定化酶概固定化方法固定化方法吸附法吸附法結合法結合法網格型網格型微囊型微囊型熱處理熱處理法法交聯法交聯法包埋法包埋法固定化酶與游離酶相比，具有下列優點固定化酶與游離酶相比，具有下列優點（l l）極易將固定化酶與底物、產物分開；）極易將固定化酶與底物、產物分開；（2 2）可以在較長時間內進行反復分批反應和連續反應；）可以在較長時間內進行反復分批反應和連續反應；（3 3）在大多數情況下，能夠提高酶的穩定性；）在大多數情況下，能夠提高酶的穩定性；（4 4）酶反應過程能夠加以嚴格控制；）酶反應過程能夠加以嚴格控制；（5 5）產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；）產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純

4、工藝；（6 6）較游離酶更適合于多酶反應；）較游離酶更適合于多酶反應；（7 7）可以增加產物的收率，提高產物的質量；）可以增加產物的收率，提高產物的質量；（8 8）酶的使用效率提高，成本降低。）酶的使用效率提高，成本降低。固定化技術和固定化酶概述固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）工作任務（一）固定化技術和固定化酶概固定化技術和固定化酶概固定化酶操作的注意事項固定化酶操作的注意事項 活性中心活性中心：保護酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基：保護酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在制備固定化酶時，酸基團固有的高級結構不受到損害，在制備固定化酶時，需要在非常嚴

5、密的條件下進行。需要在非常嚴密的條件下進行。 功能基團功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位于酶的活性中心時，要求不參與酶的固當這些功能基團位于酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合定化結合 酶的高級結構酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強堿等處理，而且：要避免用高溫、強酸、強堿等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應盡量在非常溫和的條件下進行。應盡量

6、在非常溫和的條件下進行。固定化技術和固定化酶概述固定化技術和固定化酶概述工作任務（一）工作任務（一）固定化技術和固定化酶概固定化技術和固定化酶概吸附法吸附法 利用各種固體吸附劑將利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。上，而使酶固定化的方法。 常用的固體吸附劑有常用的固體吸附劑有活活性炭、氧化鋁、硅藻土、多性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石羥基磷灰石等。等。固定化技術固定化技術 操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。 由于靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不

7、牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術包埋法包埋法 將酶或含酶菌體包埋在各種多將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。孔載體中，使酶固定化的方法。固定化技術固定化技術 包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、光交聯樹脂、聚酰胺、火棉膠等。工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術根據載體材料和方法的不同，可分為：根據載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠凝膠內部的微孔中，內部的微孔中，制成一定形狀的固定化酶或固定化含

8、酶菌體。大多數為球制成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。狀或片狀，也可按需要制成其他形狀。 常用的凝膠有常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂等合成等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。凝膠。 半透膜包埋法半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰內，制成固定化酶。常用于制備固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉膠膜等胺膜、火棉膠膜等 固定化技術固定化技

9、術工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術（1）瓊脂凝膠包埋法）瓊脂凝膠包埋法 將一定量的瓊脂加入到一定體積的水中，加熱使將一定量的瓊脂加入到一定體積的水中，加熱使之溶解，然后冷卻至之溶解，然后冷卻至4855C，加入一定量的酶，加入一定量的酶液，迅速攪拌均勻后，趁熱分散在預冷的甲苯或四液，迅速攪拌均勻后，趁熱分散在預冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒，分離后氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒，分離后洗凈備用。洗凈備用。缺點：機械強度較差，底物、產物擴散困難，故使缺點：機械強度較差，底物、產物擴散困難，故使用受限制用受限制固定化技術固定化技術工作任務（二）工作任務（二）固

10、定化技術固定化技術（2）海藻酸鈣凝膠包埋法）海藻酸鈣凝膠包埋法 稱取一定量的海藻酸鈉，溶于水，配制成一定稱取一定量的海藻酸鈉，溶于水，配制成一定濃度的海藻酸鈉溶液，經殺菌冷卻后，與一定體積濃度的海藻酸鈉溶液，經殺菌冷卻后，與一定體積的酶液或細胞混合均勻，然后用注射器或滴管將冷的酶液或細胞混合均勻，然后用注射器或滴管將冷凝懸液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中。凝懸液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中。優點：優點：操作簡便、條件溫和，對細胞無毒害，通過操作簡便、條件溫和，對細胞無毒害，通過改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑。改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑。使用時注意控制培養基中磷酸鹽的濃度，維持一定使用

11、時注意控制培養基中磷酸鹽的濃度，維持一定的鈣離子濃度。的鈣離子濃度。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術海藻酸鈣包埋法裝置海藻酸鈣包埋法裝置 將水溶性的海藻酸鈉配成將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細胞分散水溶液，并把酶或細胞分散在其中，然后將其滴入凝固在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用浴中（常用CaClCaCl2 2 溶液），溶液），使海藻酸鈉中的使海藻酸鈉中的Na+Na+，部分被，部分被CaCa2+2+所取代而形成由多價離所取代而形成由多價離子交聯的離子網絡凝膠。子交聯的離子網絡凝膠。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技

12、術 （3 3）角叉菜膠包埋法）角叉菜膠包埋法 角叉菜，屬褐藻門，杉藻科，角叉菜屬，自然分布于大西洋角叉菜，屬褐藻門，杉藻科，角叉菜屬，自然分布于大西洋沿岸和我國東南沿海以及青島、大連等海域，是中國的一種沿岸和我國東南沿海以及青島、大連等海域，是中國的一種重要經濟海藻。角叉菜不僅是重要經濟海藻。角叉菜不僅是卡拉膠卡拉膠生產的重要原藻，而且生產的重要原藻，而且近年來越來越多地應用于醫藥領域，引起人們的廣泛關注。近年來越來越多地應用于醫藥領域，引起人們的廣泛關注。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術 將一定量的角叉菜膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶解。將一定量的角叉菜

13、膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶解。滅菌后冷卻到滅菌后冷卻到30-5030-50C C，與一定量的酶液等混合均勻后，與一定量的酶液等混合均勻后，趁熱滴到預冷的氯化鉀溶液中，或者先滴到冷的植物油中，趁熱滴到預冷的氯化鉀溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化鉀溶液中的到球狀固定化顆粒。成型后再置于氯化鉀溶液中的到球狀固定化顆粒。 優點：通透性能好，對細胞無毒害。優點：通透性能好，對細胞無毒害。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術 （4 4）明膠包埋法）明膠包埋法 將一定量的明膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶將一定量的明膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶解。滅菌后

14、冷卻到解。滅菌后冷卻到3535C C以上，與一定量的酶液等以上，與一定量的酶液等混合均勻后制成所需形狀的膠粒。機械強度不夠混合均勻后制成所需形狀的膠粒。機械強度不夠可用戊二醛等雙功能試劑交聯。可用戊二醛等雙功能試劑交聯。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術（5 5）聚丙烯酰胺凝膠包埋法）聚丙烯酰胺凝膠包埋法 先配置一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺與一定量先配置一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺與一定量的酶液等混合均勻后加入一定量的過硫酸鈣和四甲基乙二胺，的酶液等混合均勻后加入一定量的過硫酸鈣和四甲基乙二胺，混合后讓其靜置聚合即可獲得。混合后讓其靜置聚合即可獲

15、得。優點：機械強度高，可調節凝膠孔徑優點：機械強度高，可調節凝膠孔徑缺點：丙烯酰胺單體有毒性缺點：丙烯酰胺單體有毒性固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術（6 6）光交聯樹脂包埋法）光交聯樹脂包埋法例：相對分子量為例：相對分子量為1000-30001000-3000的的光交聯聚氨酯光交聯聚氨酯預聚物等，加入預聚物等，加入1%1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至5050，然后，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射用紫外照射3min3min，

16、就可制得，就可制得 優點：強度高、使用時間長固定化時間短優點：強度高、使用時間長固定化時間短固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術（7 7）半透膜（微囊型）包埋法）半透膜（微囊型）包埋法 是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。半透膜的孔徑只有幾酶。半透膜的孔徑只有幾至幾十至幾十，所以也稱為微囊化法。，所以也稱為微囊化法。 適用于底物和產物都是小分子物質的固定化適用于底物和產物都是小分子物質的固定化固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術結合法結合法 選擇適宜的載體

17、，使之通過共價鍵或離子鍵選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。與酶結合在一起的固定化方法。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：根據酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法：離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶于水的離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有離子交換劑。常用的有DEAE-DEAE-纖維素纖維素、TEAE-TEAE-纖維素纖維素、DEAE-D

18、EAE-葡聚葡聚糖凝膠糖凝膠等。等。 共價鍵結合法：共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。共價鍵結合法所采用的載體主要有：共價鍵結合法。共價鍵結合法所采用的載體主要有：纖維素纖維素、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠、甲殼質甲殼質、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀甲基丙稀醇共聚物醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使使載體

19、活化載體活化，固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術交聯法交聯法借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法。狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質的游離氨基反應，形成席夫（游離氨基反應，形成席夫（SchiffSchiff）堿，而使酶或菌）堿，而使酶或菌體蛋白交聯，制成固定化酶或固定化菌體。體蛋白交聯，制成固定化酶或固定化菌體。常用的雙功能常用的雙功能試劑有戊二醛、試劑有戊二醛、己二胺、順丁己二胺、順丁烯二酸酐、雙烯二

20、酸酐、雙偶氮苯等。其偶氮苯等。其中應用最廣泛中應用最廣泛的是的是戊二醛戊二醛。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術 交聯法制備的固定化酶或固定化菌體交聯法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固結合牢固，可以長，可以長時間使用。但由于交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基時間使用。但由于交聯反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯，致使團被交聯，致使酶活力損失較大酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的或固定化菌體的顆粒較小顆粒較小，給使用帶來不便。為此，給使用帶來不便。為此，可將可將交聯法與吸附法或包埋法聯合使用，以取長補短交聯法與吸附法

21、或包埋法聯合使用，以取長補短。 固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術熱處理法熱處理法 將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內而制備得到的固定化菌體。在菌體內而制備得到的固定化菌體。 只適用于熱穩定性較好的酶的固定化，嚴格控制加熱溫只適用于熱穩定性較好的酶的固定化，嚴格控制加熱溫度和時間。度和時間。 熱處理法也可以與交聯法或其他固定化方法聯合使用。熱處理法也可以與交聯法或其他固定化方法聯合使用。固定化技術固定化技術 工作任務（二）工作任務（二）固定化技術固定化技術固定化酶的特性固定化酶的特性 將酶

22、或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定化菌將酶或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定化菌體以后，由于受到載體等的影響，酶的特性可能會體以后，由于受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。有些變化。 1 1、固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。、固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。 貯存穩定性和操作穩定性比游離酶大多數提高貯存穩定性和操作穩定性比游離酶大多數提高對熱穩定性絕大多數提高對熱穩定性絕大多數提高對蛋白類分解酶的穩定性提高對蛋白類分解酶的穩定性提高對變性劑的耐受力升高對變性劑的耐受力升高工作任務（三）工作任務（三）固定化酶的特性固定化酶的特性 2 2、固定化酶的、固定化酶的最適作用溫度最

23、適作用溫度一般與游離酶差不多，活化一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。能也變化不大。 3 3、固定化酶的、固定化酶的底物特異性底物特異性與游離酶比較可能有些不同，與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關系。固定化酶底物特其變化與底物分子量的大小有一定關系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起。異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起。 4 4、酶經過固定化后，其作用的最適、酶經過固定化后，其作用的最適pHpH值往往會發生一些值往往會發生一些變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。 影響固定化酶最適影響固定化酶

24、最適pHpH值的因素主要有兩個：一個是載體的值的因素主要有兩個：一個是載體的帶電性質，載體帶負電荷，帶電性質，載體帶負電荷，pHpH向堿性方向移動，載體帶正向堿性方向移動，載體帶正電荷，電荷，pHpH向酸性方向移動；另一個是酶催化反應產物的性向酸性方向移動；另一個是酶催化反應產物的性質，催化反應的產物為酸性時，固定化酶的最適質，催化反應的產物為酸性時，固定化酶的最適pHpH值比游值比游離酶的離酶的pHpH值高；反之則低。值高；反之則低。固定化酶的特性固定化酶的特性工作任務（三）工作任務（三）固定化酶的特性固定化酶的特性5 5、 評價固定化酶的指標：評價固定化酶的指標：（1 1）固定化酶的比活）

25、固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（位面積（cmcm2 2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2 2）操作半衰期操作半衰期：衡量穩定性的指標。：衡量穩定性的指標。 連續測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（連續測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t t1/21/2）（3 3）相對酶活力：相對酶活力： 具有相同酶蛋白（或具有相同酶蛋白（或RNARNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力相

26、對酶活力固定化酶的特性固定化酶的特性工作任務（三）工作任務（三）固定化酶的特性固定化酶的特性固定化酶的應用固定化酶的應用1 1、固定化酶在工業生產中的應用、固定化酶在工業生產中的應用（1 1）氨基酰化酶）氨基酰化酶世世界上第一種工業化生產的固定化酶。界上第一種工業化生產的固定化酶。 19691969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶氨基酰化酶. .（2 2）植酸酶）植酸酶 植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱，屬類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶。磷酸單酯水解

27、酶。 固定化植酸酶已經工業化生產，廣泛用于飼料行業。固定化植酸酶已經工業化生產，廣泛用于飼料行業。工作任務（四）工作任務（四）固定化酶的應用固定化酶的應用葡萄糖異構酶葡萄糖異構酶 世界上生產規模最大，應用世界上生產規模最大，應用最為成功的一種固定化酶。最為成功的一種固定化酶。工作任務（四）工作任務（四）固定化酶的應用固定化酶的應用固定化酶的應用固定化酶的應用（3 3）高果糖漿的生產）高果糖漿的生產- -葡萄糖異構酶葡萄糖異構酶（4 4）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶又稱為乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖又稱為乳糖酶，用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖用于制造低乳糖奶。已于和葡萄糖用于制造低乳糖奶。已于19771977年實現工業化年實現工業化（5 5）延胡索酸酶）延胡索酸