1、中藥飼料添加劑調控仔豬腸道中藥飼料添加劑調控仔豬腸道微生態平衡研究進展微生態平衡研究進展孔祥峰，印遇龍孔祥峰，印遇龍中國科學院亞熱帶農業生態研究所中國科學院亞熱帶農業生態研究所畜禽健康養殖研究中心畜禽健康養殖研究中心 2010.10.17報告提綱報告提綱 中藥飼料添加劑介紹中藥飼料添加劑介紹 腸道菌群的功能腸道菌群的功能 腸道菌群發育規律腸道菌群發育規律 中草藥功效與腸道菌群中草藥功效與腸道菌群 腸道菌群的中草藥飼料添加劑調控腸道菌群的中草藥飼料添加劑調控中藥飼料添加劑介紹中藥飼料添加劑介紹 概念：中藥飼料添加劑，顧名思義就是以中藥為原料制成概念：中藥飼料添加劑，顧名思義就是以中藥為原料制成的

2、飼料添加劑。的飼料添加劑。 分類：從營養角度可將飼料添加劑分為營養性和非營養性分類：從營養角度可將飼料添加劑分為營養性和非營養性飼料添加劑兩大類。由于中藥含有多種有效成分，兼有營飼料添加劑兩大類。由于中藥含有多種有效成分，兼有營養和藥用功能，基本具備飼料添加劑的所有作用，可作為養和藥用功能，基本具備飼料添加劑的所有作用，可作為一類獨立的飼料添加劑。一類獨立的飼料添加劑。 特性：中藥多為復雜的有機物，其組成成分均在數十種，特性：中藥多為復雜的有機物，其組成成分均在數十種，甚至達到上百種，按照甚至達到上百種，按照“構效關系構效關系”理論（即一種成分可理論（即一種成分可產生一種作用）來說，中藥具有產

3、生一種作用）來說，中藥具有“多能性多能性” 。 中藥飼料添加劑的分類中藥飼料添加劑的分類 鑒于中藥飼料添加劑的特殊性，目前尚無統一的分類標鑒于中藥飼料添加劑的特殊性，目前尚無統一的分類標準。一般按照藥材來源、原料類型、產品作用、組方和劑型準。一般按照藥材來源、原料類型、產品作用、組方和劑型進行分類。進行分類。 按藥材來源：分為植物類（山楂、黃芪等）、動物類（雞內按藥材來源：分為植物類（山楂、黃芪等）、動物類（雞內金、地龍等）、礦物類（麥飯石等）和化合物類。金、地龍等）、礦物類（麥飯石等）和化合物類。 按原料類型：分為原產物、加工提取物（刺五加提取物、黃按原料類型：分為原產物、加工提取物（刺五加

4、提取物、黃芪多糖等）和副產物（黨參莖葉、人參渣、沙棘果渣等）。芪多糖等）和副產物（黨參莖葉、人參渣、沙棘果渣等）。 按照劑型：分為常規散劑、復方提取物粉劑和顆粒劑、超微按照劑型：分為常規散劑、復方提取物粉劑和顆粒劑、超微粉等劑型。目前常用的中藥飼料添加劑是常規散劑。粉等劑型。目前常用的中藥飼料添加劑是常規散劑。 中藥飼料添加劑的分類中藥飼料添加劑的分類 按照組方：分為單味中藥提取物、單味中藥、復方中藥和按照組方：分為單味中藥提取物、單味中藥、復方中藥和中西藥結合飼料添加劑。目前一般使用的是復方中藥添加中西藥結合飼料添加劑。目前一般使用的是復方中藥添加劑，即在中獸醫理論指導下，依據君臣佐使的法則

5、遣方用劑，即在中獸醫理論指導下，依據君臣佐使的法則遣方用藥，以發揮其群藥的綜合作用。藥，以發揮其群藥的綜合作用。 按產品作用：分為防病保健按產品作用：分為防病保健(增強免疫、抗菌驅蟲、健胃消增強免疫、抗菌驅蟲、健胃消食、養血滋陰、清熱解毒、安神行氣食、養血滋陰、清熱解毒、安神行氣)、增加生產性能、增加生產性能(主主要用于促生長、促生殖、提高肉、蛋、奶及經濟動物產品要用于促生長、促生殖、提高肉、蛋、奶及經濟動物產品產量產量)、提高產品質量、提高產品質量(如用姜黃素改善雞蛋品質，用紅辣如用姜黃素改善雞蛋品質，用紅辣椒、萬壽菊等改善肉雞的肉品質椒、萬壽菊等改善肉雞的肉品質 )和改善飼料品質和改善飼料

6、品質(如用大如用大蒜素刺激動物食欲、延長飼料貯存期蒜素刺激動物食欲、延長飼料貯存期 )等四類。等四類。 生物拮抗生物拮抗免疫功能免疫功能營養功能營養功能胃胃腸腸道道菌菌群群有有益益作作用用維生素的合成與代謝維生素的合成與代謝蛋白質合成與氮代謝蛋白質合成與氮代謝多糖和粗纖維分解代謝多糖和粗纖維分解代謝脂類的分解代謝脂類的分解代謝胃腸道菌群的功能胃腸道菌群的功能增加免增加免疫成本疫成本競爭營養物質競爭營養物質產生有害氨產生有害氨基酸代謝物基酸代謝物改變腸道的改變腸道的結構與功能結構與功能降低脂肪降低脂肪的消化率的消化率胃腸道菌群的功能胃腸道菌群的功能 實驗動物實驗動物：1、7、14、21和28日齡

7、的哺乳仔豬各6頭。 樣品采集樣品采集：取空腸、回腸、盲腸和結腸內容物，提細菌DNA。 試驗方法與測定指標試驗方法與測定指標：PCR-DGGE技術比較腸道菌群的結構和多樣性，Real-time PCR方法定量腸道優勢菌群 。哺乳仔豬腸道菌群發育規律研究哺乳仔豬腸道菌群發育規律研究細菌引物序列產物大小乳酸桿菌Lab-0159Univ-05155- AAGATGCAGCTCTTGTGTTG-35- ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3356 bp雙歧桿菌Bif-xfp-2294-fBif-xfp-2691-r5- ACCAAGGTCAACCTCCTCTCTG-35- TGCCCAGA

8、TTCAGCAAAGTCC-3397 bp腸桿菌F-entR-ent5- ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-35- CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3300 bp鏈球菌16S-19516S-4895- CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3 5- GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3 294 bp試驗結果試驗結果 隨日齡增加，腸道菌群結構變得復雜多樣，且腸道后段菌群隨日齡增加，腸道菌群結構變得復雜多樣，且腸道后段菌群多樣性高于腸道前段；多樣性高于腸道前段； 每一仔豬個體都有自己獨特的腸道微生物組成，日齡越小，每一仔豬個體都有自己獨特的腸道微生物組

9、成，日齡越小，不同個體間菌群差異越小。不同個體間菌群差異越小。盲腸微生物DGGE圖譜 結腸微生物DGGE圖譜 回腸微生物DGGE圖譜 試驗結果試驗結果 17日齡仔豬胃腸道內乳酸菌、鏈球菌和腸桿菌占細菌總數的比例較高，日齡仔豬胃腸道內乳酸菌、鏈球菌和腸桿菌占細菌總數的比例較高，出生出生1周后乳酸桿菌豐度降低，雙歧桿菌等厭氧菌開始成為腸道優勢菌，周后乳酸桿菌豐度降低，雙歧桿菌等厭氧菌開始成為腸道優勢菌，14天后空腸和回腸鏈球菌豐度增加。天后空腸和回腸鏈球菌豐度增加。 運用基于運用基于16SrDNA16SrDNA克隆文庫克隆文庫技術構建了技術構建了3 3個克隆文庫并測序個克隆文庫并測序分析，共得到分

10、析，共得到536536條非嵌合的條非嵌合的16SrDNA16SrDNA全長序列。根據全長序列。根據99%99%的的序列相似性劃分為序列相似性劃分為157157個進化型，個進化型，其中主要的優勢菌群在系統發其中主要的優勢菌群在系統發育地位上基本屬于乳酸桿菌屬、育地位上基本屬于乳酸桿菌屬、鏈球菌屬、羅氏菌屬、梭菌屬鏈球菌屬、羅氏菌屬、梭菌屬和葡萄球菌屬。其中和葡萄球菌屬。其中2121和和2828日日齡哺乳仔豬以及齡哺乳仔豬以及2121日齡斷奶后日齡斷奶后1 1周仔豬分別測序了周仔豬分別測序了171171、194194和和171171個克隆，各自劃分為個克隆，各自劃分為4040、6161和和5656

11、個個OTUsOTUs。 哺乳和斷奶仔豬回腸微生物發育樹哺乳和斷奶仔豬回腸微生物發育樹 哺乳仔豬哺乳仔豬斷奶仔豬斷奶仔豬斷奶對仔豬胃腸道菌群發育規律的影響斷奶對仔豬胃腸道菌群發育規律的影響 發現斷奶應激使仔豬腸道鏈球菌屬增加發現斷奶應激使仔豬腸道鏈球菌屬增加23%，乳酸桿菌屬，乳酸桿菌屬降低降低36%，腸道菌群失調是引起腹瀉的主要原因。，腸道菌群失調是引起腹瀉的主要原因。88%52%3.5%26.3%斷奶對仔豬回腸優勢微生物的影響斷奶對仔豬回腸優勢微生物的影響 斷奶對仔豬胃腸道菌群發育規律的影響斷奶對仔豬胃腸道菌群發育規律的影響中草藥功效與胃腸道菌群中草藥功效與胃腸道菌群 中醫用藥的特色之一就是

12、以湯劑的形式口服用藥。中醫用藥的特色之一就是以湯劑的形式口服用藥。 湯劑在發揮藥效作用前，除了在炮制、煎煮過程中會產生動湯劑在發揮藥效作用前，除了在炮制、煎煮過程中會產生動態變化外，進入機體后亦要發生一系列的動態變化。這種變態變化外，進入機體后亦要發生一系列的動態變化。這種變化的第一個過程就是在消化道內被消化液和腸內細菌生物轉化的第一個過程就是在消化道內被消化液和腸內細菌生物轉化和化和/代謝。代謝。 藥物在消化道內的行為包括：調節腸內微生態，引發生物活藥物在消化道內的行為包括：調節腸內微生態，引發生物活性物質如雙歧因子分泌，產生生物效應；破壞腸內微生態平性物質如雙歧因子分泌，產生生物效應；破壞

13、腸內微生態平衡而促進新的平衡系統建立。衡而促進新的平衡系統建立。 由此可見，腸內細菌對中藥成分結構的生物轉化和由此可見，腸內細菌對中藥成分結構的生物轉化和/代謝在中代謝在中藥藥效上起著重要的作用。藥藥效上起著重要的作用。 中草藥功效與胃腸道菌群中草藥功效與胃腸道菌群 利用中藥成分的腸內細菌生物轉化和利用中藥成分的腸內細菌生物轉化和/代謝模型體外研究代謝模型體外研究中藥成分在腸內是如何被細菌轉化和代謝的，更接近于中藥成分在腸內是如何被細菌轉化和代謝的，更接近于真實情況，對揭示中藥作用機制具有十分重要的意義。真實情況，對揭示中藥作用機制具有十分重要的意義。 “十一五十一五”國家科技支撐計劃重點項目

14、國家科技支撐計劃重點項目“中獸藥現代化中獸藥現代化技術研究與開發技術研究與開發”的部分內容：依據生物體內藥物代謝的部分內容：依據生物體內藥物代謝轉化機理，利用益生菌和發酵技術，提高中藥有效部分轉化機理，利用益生菌和發酵技術，提高中藥有效部分的生物活性，增加其產量；利用中藥與益生菌間的相互的生物活性，增加其產量；利用中藥與益生菌間的相互作用，提高菌、藥生物學效應，改善其生物利用度。作用，提高菌、藥生物學效應，改善其生物利用度。胃腸道菌群的中草藥飼料添加劑調控胃腸道菌群的中草藥飼料添加劑調控 實驗動物和分組：實驗動物和分組：60頭頭21日齡斷奶仔豬，隨機分為日齡斷奶仔豬，隨機分為3組，組，每組每組

15、20重復。處理重復。處理1添加添加0.1%刺五加提取物，處理刺五加提取物，處理2添加添加0.02粘桿菌素，處理粘桿菌素，處理3為基礎日糧。為基礎日糧。 樣品采集：分別于試驗開始后第樣品采集：分別于試驗開始后第7、14和和28 d從各處理隨機從各處理隨機選取選取5頭試豬，處死后取空腸、回腸、盲腸和結腸內容物，頭試豬，處死后取空腸、回腸、盲腸和結腸內容物，提取細菌提取細菌DNA。 試驗方法與測定指標：體外培養菌落計數法計數大腸桿菌試驗方法與測定指標：體外培養菌落計數法計數大腸桿菌和乳酸桿菌的數量，和乳酸桿菌的數量，PCR-DGGE技術比較腸道菌群的結構技術比較腸道菌群的結構和多樣性。和多樣性。試驗

16、結果試驗結果 細菌計數結果表明，細菌計數結果表明，2121日齡斷日齡斷奶仔豬日糧中添加刺五加提取奶仔豬日糧中添加刺五加提取物，可顯著抑制腸道中大腸桿物，可顯著抑制腸道中大腸桿菌增殖，促進乳酸桿菌生長，菌增殖，促進乳酸桿菌生長，有益于斷奶仔豬的腸道健康。有益于斷奶仔豬的腸道健康。 大腸桿菌空腸5.3350.176c5.7350.114b5.9710.146a回腸5.7910.052c6.1680.104b6.4310.099a盲腸5.7780.048b6.1730.062a6.1050.098a乳酸桿菌空腸7.2860.124a6.9960.096b6.8350.474b回腸7.8590.105

17、a7.5740.072b7.5200.084b盲腸7.6610.077a7.6980.096a7.5470.088b刺五加提取物對斷奶仔豬腸道內容物細菌數量的影響刺五加提取物對斷奶仔豬腸道內容物細菌數量的影響(LgCFU/g, n=5) abb腹瀉率 (%)刺五加提取物對腹瀉率的影響刺五加提取物對腹瀉率的影響試驗結果試驗結果 添加后第添加后第7、14和和28 d時，提取物組盲腸內容物細菌種類較對時，提取物組盲腸內容物細菌種類較對照組多，第照組多，第28 d時空腸內容物細菌種類比對照組多；時空腸內容物細菌種類比對照組多；3個處理個處理間各腸段內容物細菌種類的相似性均達間各腸段內容物細菌種類的相似

18、性均達56.9%以上。提示刺以上。提示刺五加提取物能顯著增加腸道微生物的多樣性，這是其防治斷五加提取物能顯著增加腸道微生物的多樣性，這是其防治斷奶仔豬腹瀉、促進生長的機理之一。奶仔豬腹瀉、促進生長的機理之一。 添加后第添加后第7 d添加后第添加后第14 d添加后第添加后第28 d山藥多糖對微生物發酵的調控作用山藥多糖對微生物發酵的調控作用 研究目的：評價分段醇沉得到的研究目的：評價分段醇沉得到的4 4個山藥多糖的體外發酵特性個山藥多糖的體外發酵特性及其對腸道微生態的影響，探討其用做飼料添加劑的可行性。及其對腸道微生態的影響，探討其用做飼料添加劑的可行性。 采用體外發酵技術評價采用體外發酵技術評

19、價4 4個山藥多糖對盲腸食糜的體外發酵特個山藥多糖對盲腸食糜的體外發酵特性和發酵產物的影響；利用性和發酵產物的影響；利用PCR-DGGEPCR-DGGE技術比較腸道菌群的結構技術比較腸道菌群的結構和多樣性。和多樣性。 實驗動物及分組：實驗動物及分組：40 40 只只SDSD大鼠隨機分為大鼠隨機分為4 4 組，單籠飼養。對組，單籠飼養。對照組飼喂基礎日糧。處理組照組飼喂基礎日糧。處理組(II(II組、組、IIIIII組和組和IVIV組組) ) 分別在基礎分別在基礎日糧中添加日糧中添加0.250.25、0.50.5和和1.0g/kg 60%1.0g/kg 60%醇沉山藥多糖。處死后取醇沉山藥多糖。

20、處死后取空腸、回腸、盲腸和結腸內容物，提取細菌空腸、回腸、盲腸和結腸內容物，提取細菌DNADNA，測定腸道微，測定腸道微生物和揮發酸的變化。生物和揮發酸的變化。試驗結果試驗結果處理pH值NH3（mg/dl）30%醇沉多糖組6.72 0.13B20.000.42B45%醇沉多糖組5.83 0.12D6.550.76C60%醇沉多糖組5.78 0.22D3.970.24D75%醇沉多糖組6.17 0.11C3.830.37D葡萄糖對照組5.49 0.15D3.890.38D培養液對照組7.62 0.06A26.820.48A山藥多糖體外發酵模式圖山藥多糖體外發酵模式圖 發酵液的發酵液的pH值和值和

21、NH3含量（含量（n4） 75%醇沉多糖發酵動力學參數最優，醇沉多糖發酵動力學參數最優，并顯著優于葡萄糖；并顯著優于葡萄糖；45、60醇沉醇沉多糖和葡萄糖組多糖和葡萄糖組pH值最低，值最低，60、75醇沉多糖和葡萄糖組醇沉多糖和葡萄糖組NH3含量最低。含量最低。 提示提示60%和和75%醇沉醇沉山藥多糖是山藥多糖是2種理想種理想的可被豬盲腸微生物的可被豬盲腸微生物利用的碳源，并可改利用的碳源，并可改變微生物產生的變微生物產生的SCFA含量與組成。含量與組成。試驗結果試驗結果 60%和和75%醇沉山藥多糖是醇沉山藥多糖是2種理想的可被盲腸微生物利用的碳源，種理想的可被盲腸微生物利用的碳源，并可改

22、變盲腸微生態區系及產生的短鏈脂肪酸含量與組成。并可改變盲腸微生態區系及產生的短鏈脂肪酸含量與組成。60%醇沉多糖發酵動力學參數最優醇沉多糖發酵動力學參數最優60%和和75%醇沉多糖組盲腸微生態醇沉多糖組盲腸微生態具有很高的相似性，且特定菌種含具有很高的相似性，且特定菌種含量顯著提高，微生物種類減少量顯著提高，微生物種類減少1 MARK2 葡萄糖組葡萄糖組3 對照組對照組4 75%多糖組多糖組5 60%多糖組多糖組6 45%多糖組多糖組7 30%多糖組多糖組 盲腸微生盲腸微生物物DGGE電泳圖譜電泳圖譜試驗結果試驗結果時間處理乙酸丙酸 丁酸pH值第1周對照組3.80.24B5.20.26B2.4

23、0.24B7.10.48AB0.25g/kg多糖組5.50.37A6.40.66A2.90.28A6.60.48B0.5g/kg多糖組5.20.26A5.40.35B2.90.31A6.50.26B1g/kg多糖組4.00.47B5.00.85B2.30.30B7.40.20A第3周對照組4.60.24C6.10.373.20.26A7.00.110.25g/kg多糖組5.80.34A6.80.753.50.62A7.20.140.5g/kg多糖組5.30.22B6.60.383.00.22AB7.60.331g/kg多糖組4.60.30C6.10.192.60.21B7.50.35盲腸短鏈脂

24、肪酸含量 (mol/g；n4) 試驗第試驗第1周周0.25和和0.5g/kg多糖組盲腸食糜乙酸和丁酸含量顯著多糖組盲腸食糜乙酸和丁酸含量顯著高于對照組和高于對照組和1.0g/kg多糖組，多糖組，0.25g/kg多糖組丙酸含量顯著高于多糖組丙酸含量顯著高于其它組。試驗第其它組。試驗第3周周0.25g/kg多糖組乙酸含量顯著高于其它組。多糖組乙酸含量顯著高于其它組。 試驗結果試驗結果 0.25g/kg的的60%醇沉山藥多糖可被盲腸微生物利用，改變盲腸醇沉山藥多糖可被盲腸微生物利用，改變盲腸微生態區系及其產生的短鏈脂肪酸含量與組成。微生態區系及其產生的短鏈脂肪酸含量與組成。第第1周盲腸微生物周盲腸微

25、生物DGGE電泳圖譜電泳圖譜 第第3周盲腸微生物周盲腸微生物DGGE電泳圖譜電泳圖譜 從左到右依次從左到右依次Mark(1，微生物，微生物DNA標準條帶標準條帶)、對照組、對照組(24)、0.25 g/kg添加組添加組(57)、0.5 g/kg添加組添加組(810)、1 g/kg添加組添加組(1113) 唾液乳酸桿菌唾液乳酸桿菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌多糖組唾液乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌含量高于對照組，且隨試驗期延長，多糖組唾液乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌含量高于對照組，且隨試驗期延長，各多糖組優勢菌群數量增加，處理間各重復相似性提高。各多糖組優勢菌群數量增加，處理間各重復相似性提高。結束語結束語 中藥飼料添加劑具有毒副作用小、不易產生抗藥性等特點，中藥飼料添加劑具有毒副作用小、不易產生