1、克隆形成實驗細胞生長狀況有關指標的檢測方法一、細胞計數這是細胞培養中常用的根本技術之一。所用材料為血球計數板，巴氏吸管和顯微鏡。細胞計數的根本步驟：(1)取清潔計數板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干.(2)取細胞懸液0.3mL，參加0.9mL結晶紫(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數板內，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現氣泡.(3)在顯微鏡下用10×物鏡觀察計數四角大分格中的細胞數。代入下式得出細胞密度。   細胞數/ml=(4大格細胞數之和/4)×104×稀釋倍數臺盼藍染色法可計算出活細胞

2、數和死細胞數以測定細胞存活百分率。一般0.5%1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。此外還可用0.02%的藻紅B染液將死細胞或受損細胞染成紅色，或用0.05%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。細胞存活百分率=4大格活細胞數/4大格活細胞+死細胞數×100%細胞計數除用上述方法外，目前還有新型的自動計數儀，可供大規模細胞計數工作使用。各種型號的計數操作不盡相同，可根據使用說明進行操作。在進行細胞計數操作時，必須把細胞懸液準備好，細胞應分散良好，并充分混勻，假設出現較多細胞團或細胞數少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細胞懸液，重新計數。二、細胞生長曲線和

3、生長倍數細胞生長曲線是細胞培養實驗中最根本的指標，是測定細胞絕對增長數值和生長繁殖根本規律常用的簡便方法。常用的方法為：在同一規格的培養瓶中，接種同等量的同一代細胞，經培養后每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數，以培養時間為橫座標，不同時刻的細胞數的對數為底座標，標出各點并連成線，即為該細胞的生長曲線，可反響出細胞生長的動態。測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養板，分7組，每組3孔，培養一周(7天)，期間逐日檢測一組，計數，最后把7天中的細胞數值繪成圖，即為細胞生長曲線。也可采用MTT法來進行生長曲線測定，較上述方法簡便。標準的細胞生長曲線近似“S形，一般在傳代后第一天細胞數有所減少

4、，經過一段時間的潛伏期，再進入對數生長期，到達平臺期和生長穩定，最后衰老。細胞生長倍數是指測定接種時活細胞的濃度，經一個生長周期到達最大活細胞濃度的比率。    生長倍數=培養后最大活細胞濃度/接種時的活細胞濃度三、細胞分裂指數細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個細胞中的分裂細胞數來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理12小時后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數目，重復4次取平均值，用百分比表示。根本步驟：(1)細胞準備   用蓋片(支持物)培養法。(2)每24小時取出一個小玻片，按常規方法進行固

5、定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區域觀察分裂細胞并計數。逐個視野進行，對每一時間組的玻片各取細胞多、中、少3個區域各一區，共數1000個細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。細胞分裂指數=細胞分裂相數/細胞總數(1000)×1000四、細胞接種存活率細胞接種存活率又稱細胞貼壁率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(25個細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)的細胞百分數值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。根本步驟：1取對生長

6、期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數后按檢測細胞生長曲線的接種細胞的原那么，將細胞接種于培養瓶(濃度相對高些)。接種1215瓶。2每2小時取出一瓶細胞，倒掉培養液，然后參加胰酶消化已貼壁細胞，計數已貼壁細胞，用下面公式逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察24小時即12。   接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細胞數/接種細胞數)×100%五、克隆形成率細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同

7、，細胞克隆形成率差異也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。1、平板克隆形成試驗根本步驟：(1)取對數生長期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。(2)將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以適當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10

8、mL 37預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37 5% CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養23周。(3)經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染1030分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣枯燥。(4)將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。             克隆數

9、    克隆形成率= ×100%             接種細胞數平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。2、軟瓊脂培養克隆形成試驗根本步驟：(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40中不會凝固。(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加710mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中參加0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37