1、 蛋白質與酶工程蛋白質與酶工程酶的提取、分離和純化酶的提取、分離和純化檢驗醫(yī)學院張雪梅一、概述一、概述二、酶的提取二、酶的提取三、酶的分離純化三、酶的分離純化四、酶的結晶四、酶的結晶五、濃縮與干燥五、濃縮與干燥六、酶純化步驟的設計及評價六、酶純化步驟的設計及評價酶的提取、分離和純化 一、概述一、概述 1-1 1-1 酶提取與分離純化的定義酶提取與分離純化的定義 將酶從細胞或其它含酶原料中將酶從細胞或其它含酶原料中提取提取出來，出來，再與再與其它物質分開其它物質分開，從而獲得所需酶的技，從而獲得所需酶的技術過程術過程 * *酶的純化程度根據(jù)酶的純化程度根據(jù)需要需要而定而定 * *純化方法多種多樣

2、，為獲得較好的效純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是果往往是2 2種或種或2 2種以上種以上聯(lián)合應用聯(lián)合應用 1-2 1-2 提取純化之目的提取純化之目的1)1)酶催化功能的應用酶催化功能的應用2)2)酶學研究酶學研究 酶的結構、功能、催化機制、催化動力學酶的結構、功能、催化機制、催化動力學 酶的生物合成及其調控規(guī)律等酶的生物合成及其調控規(guī)律等 1-3 1-3 純化的必要性純化的必要性1)1)生物細胞中同時存在多種多樣的酶生物細胞中同時存在多種多樣的酶2)2)多酶可能作用于同一個底物多酶可能作用于同一個底物3)3)酶在生物細胞中的分布并不是均一的酶在生物細胞中的分布并不是均一的二、酶的提取

3、二、酶的提取（extraction)extraction)2-1 2-1 了解所分離酶在細胞中的分布了解所分離酶在細胞中的分布 1 1、細胞外酶：、細胞外酶：由細胞內產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用由細胞內產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于的酶；大多屬于水解酶水解酶，通常含量高，容易得到，通常含量高，容易得到2 2、細胞內酶、細胞內酶：在細胞內合成后并不分泌到細胞外，：在細胞內合成后并不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用。該類酶在細胞內往往與而在細胞內起催化作用。該類酶在細胞內往往與細胞器結合，不僅有一定的細胞器結合，不僅有一定的區(qū)域性，區(qū)域性，而且催化的而且催化的反應具有一定反應具有一定順序性順

4、序性 v真核細胞內酶的分布真核細胞內酶的分布細胞膜：細胞膜：ATPATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等酶、腺苷酸環(huán)化酶等細胞核：細胞核：DNADNA聚合酶、連接酶和聚合酶、連接酶和RNARNA聚合酶等聚合酶等線粒體線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質合成、環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質合成、DNADNA聚聚合酶、合酶、RNARNA聚合酶等聚合酶等高爾基體：高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶多糖、核蛋白粘液生成酶溶酶體：溶酶體：各種水解酶等各種水解酶等葉綠體：葉綠體：參與光合作用形成參與光合作用形成ATPATP、

5、NADPHNADPH有關的酶有關的酶類、與暗反應有關的酶系類、與暗反應有關的酶系線粒體主要酶的分布（約有線粒體主要酶的分布（約有120120種酶）種酶）部部 位位酶酶 的的 名名 稱稱外外 膜膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-NADH-細胞色素細胞色素C C還原酶、還原酶、脂類代謝有關的酶（酰基輔酶脂類代謝有關的酶（酰基輔酶A A合成酶、脂肪酸激酶等）合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：特征酶：單胺氧化酶單胺氧化酶膜膜 間間 隙隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：特征酶：腺苷酸激酶腺苷酸激酶內內

6、膜膜細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、NADHNADH脫氫酶、肉堿酰基脫氫酶、肉堿酰基轉移酶、轉移酶、 - -羥丁酸和羥丁酸和 - -羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATPATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：特征酶：細胞色素（細胞色素（c c）氧化酶）氧化酶基基 質質檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合體、天冬氨延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合體、天冬氨酸氨基轉移酶、蛋白質和核酸合成酶系、脂肪

7、酸氧化酶系酸氨基轉移酶、蛋白質和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：特征酶：蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶2-2 2-2 起始材料的選擇起始材料的選擇 原則：原則：選取酶含量高的材料選取酶含量高的材料 可以是可以是天然天然的動植物的動植物 或或人工培養(yǎng)人工培養(yǎng)的微生物、動植物細胞等的微生物、動植物細胞等 * *注意材料的生長階段注意材料的生長階段 * *注意酶在生物體內的富集區(qū)域注意酶在生物體內的富集區(qū)域 由于從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受由于從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到到原料原料和和成本的限制成本的限制，因此，目前，因此，目前工業(yè)上工業(yè)上大多采大多采用培養(yǎng)微生物用培養(yǎng)微生物的方法來獲得

8、大量的酶制劑的方法來獲得大量的酶制劑2-3 2-3 細胞膜和細胞壁的破碎細胞膜和細胞壁的破碎1 1、主要方法：、主要方法： 1 1） 2 2）l 超聲波破碎法超聲波破碎法 3 3） 4 4）2 2、選擇原則、選擇原則如酶法+超聲 2-4 2-4 酶的提取酶的提取 1 1、定義、定義 在適當條件下，用適當?shù)奶崛∫禾幚砗冈希谶m當條件下，用適當?shù)奶崛∫禾幚砗冈希故姑赋浞秩苡谄渲忻赋浞秩苡谄渲械倪^程。的過程。 2 2、提取液的選擇、提取液的選擇 根據(jù)酶的結構根據(jù)酶的結構和和溶解特性溶解特性來選擇適當?shù)奶崛∫簛磉x擇適當?shù)奶崛∫?* *極性物質極性物質易溶解于易溶解于極性溶劑，極性溶劑，反之，

9、反之，即即相似相溶相似相溶 * *酸性物質酸性物質易溶解于易溶解于堿性溶液堿性溶液，反之亦然。反之亦然。2-4 2-4 酶的提取酶的提取3 3、常用的提取液：酶通常都溶于、常用的提取液：酶通常都溶于水水，因此通常用水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進行抽提溶液進行抽提4 4、有些酶、有些酶與脂質結合與脂質結合或或含有較多的非極性基團含有較多的非極性基團，則則可用可用有機溶劑抽提，如：有機溶劑抽提，如：丙酮粉，丙酮粉，有助于有助于酶與脂酶與脂肪或磷脂膜分離；肪或磷脂膜分離； 高離子強度水溶液也高離子強度水溶液也有助于有助于酶從

10、結合的膜上解酶從結合的膜上解析下來。析下來。2-5 2-5 主要的提取方法主要的提取方法1 1、鹽溶液提取、鹽溶液提取 該法用于在該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶低濃度鹽溶液中溶解度大的酶的提取的提取 常用的鹽濃度：常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L0.02-0.05mol/L，大多數(shù)，大多數(shù)P P酶酶用該用該 法提取法提取 R R酶酶常用常用0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液提取。溶液提取。 * *鹽溶現(xiàn)象：鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象而增加的現(xiàn)象 * *鹽析現(xiàn)象：鹽析現(xiàn)象：當鹽濃

11、度達到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽當鹽濃度達到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象濃度升高而降低的現(xiàn)象2 2、酸溶液提取、酸溶液提取 在酸性條件下在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法的酶可用此法 如：胰蛋白酶（如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用可用0.12mol/L0.12mol/L的硫酸的硫酸溶液溶液3 3、堿溶液提取、堿溶液提取 在堿性條件下在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用的酶該法適用 如：大腸埃希菌的如：大腸埃希菌的L-L-天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（pI=4.85）可可用用pH11-12.5pH11-12.5的溶液的溶液 4 4、有機溶劑提取：

12、如、有機溶劑提取：如酶與脂質結合牢固，或含酶與脂質結合牢固，或含有較多非極性基團的酶，可用有較多非極性基團的酶，可用與水混溶的有機與水混溶的有機溶劑溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），（乙醇、丙酮、丁醇等），如：如： P P酶：酶：膽堿酯酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫膽堿酯酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用氫酶等用丁醇丁醇萃取，有較好效果萃取，有較好效果 R R酶：酶：可用可用酸苯酚溶液酸苯酚溶液提取提取 主要的提取方法小結主要的提取方法小結地5 5、影響酶提取的其它重要因素、影響酶提取的其它重要因素l溫度：溫度：適當提高，適當提高，可以提高酶的溶解度和酶分子可以提高酶的溶解度和酶分子的擴散速度；的擴

13、散速度；過高過高則引起酶失活則引起酶失活lpH:pH: 在等電點條件下，酶的溶解度最小；為提高在等電點條件下，酶的溶解度最小；為提高溶解度，要溶解度，要避開酶的等電點避開酶的等電點; ;但是，也但是，也不宜偏離不宜偏離pIpI太遠太遠（過高或過低），以免引起（過高或過低），以免引起酶變性失活酶變性失活l 提取液體積提取液體積 * *適當增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率適當增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率 * *過量，則降低過量，則降低 酶酶 ，增加后續(xù)分離純化的難度，增加后續(xù)分離純化的難度 一般為一般為原始材料的原始材料的3-53-5倍，倍，且分且分3 3次使用次使用 l 加入保護劑，加入保護劑，以提

14、高酶的穩(wěn)定性以提高酶的穩(wěn)定性 如酶的如酶的底物、輔酶底物、輔酶和某些和某些抗氧化劑抗氧化劑 三、酶的分離純化三、酶的分離純化（isolation,separation) ( purification)isolation,separation) ( purification) 3-1 3-1 分離純化方法分類分離純化方法分類 1 1、基于分子大小或質量、基于分子大小或質量 (1)(1)離心離心 (2)(2)透析透析 (3)(3)凝膠過濾凝膠過濾 (4)(4)超過濾超過濾 2 2、基于電荷、基于電荷 (1) (1) 離子交換色譜離子交換色譜 (2) (2) 電泳電泳 (3) (3) 等電聚焦等電聚

15、焦 3 3、基于溶解度、基于溶解度 改變改變pHpH、離子強度、介電常數(shù)等實現(xiàn)的、離子強度、介電常數(shù)等實現(xiàn)的沉淀分離：沉淀分離： (1) (1) 鹽析法鹽析法 (2) (2) 復合沉淀法復合沉淀法 (3) (3) 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 (4) (4) 等電點沉淀法等電點沉淀法 (5) (5) 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法4 4、基于特異性結合位置、基于特異性結合位置/ /親和力的差異親和力的差異 親和色譜（層析）親和色譜（層析）5 5、其它方法（略）、其它方法（略） （1 1）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法 （2 2）基于疏水作用的差異：

16、疏水層析）基于疏水作用的差異：疏水層析 （3 3）在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附）在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附 （4 4）羥基磷灰石色譜）羥基磷灰石色譜 （5 5）冷凍干燥（濃縮）冷凍干燥（濃縮）1 1、沉淀分離、沉淀分離3-2 3-2 常用的分離純化方法常用的分離純化方法取正常人血清5ml加等量生理鹽水混勻攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨使飽和度為204，10min離心(3000rpm), 10min，棄沉淀 上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨使飽和度為50 。 置4，3小時以上離心(3000rpm), 10min，棄上清所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml 裝入透析袋中對PBS充分透析（換液3次）萘氏

17、試劑測透析外液無黃色取少許透析袋液適當倍數(shù)稀釋后，測蛋白含量。 例例 鹽析純化血清免疫球蛋白鹽析純化血清免疫球蛋白2 2、離心（、離心（centrifugation)centrifugation)（1 1）定義：）定義：利用離心機旋轉產(chǎn)生的離心力，使利用離心機旋轉產(chǎn)生的離心力，使不不同大小、不同密度同大小、不同密度的顆粒分離的技術過程。的顆粒分離的技術過程。 * *優(yōu)點：優(yōu)點：處理量大，可達幾升處理量大，可達幾升 * *離心條件的選擇：離心條件的選擇：以靶酶與雜質的顆粒大小、以靶酶與雜質的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當?shù)碾x心機、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離

18、心條件離心方法和離心條件 v常速常速/ /低速離心機：低速離心機：主要用于細胞、細胞碎片和培主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等養(yǎng)基殘渣等有形物質分離有形物質分離，也可分離，也可分離較大顆粒的酶較大顆粒的酶結晶分離；結晶分離；v高速離心機高速離心機：最大轉速：最大轉速1 12.5x102.5x104 4rpmrpm。在酶的分離。在酶的分離中，主要用于中，主要用于沉淀沉淀及細胞碎片和細胞器的及細胞碎片和細胞器的分離；分離；為為防止離心過程中溫度升高而致酶失活，一般用防止離心過程中溫度升高而致酶失活，一般用高速高速冷凍離心機；冷凍離心機；v超速離心機超速離心機：最大轉速達：最大轉速達2.52.51

19、2x1012x104 4rpmrpm。主要用。主要用于于DNADNA、RNARNA（酶）、蛋白質（酶）、蛋白質( (酶）等酶）等生物大分子以生物大分子以及細胞器、病毒及細胞器、病毒等的分離純化等。等的分離純化等。（2 2）離心機的常用分類）離心機的常用分類 差速離心差速離心（differential centrifugation)differential centrifugation)：即采用即采用不同的離心速度和離心時間不同的離心速度和離心時間，使不同沉降使不同沉降速度的顆粒速度的顆粒分批分離分批分離。 主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡單、主要用于分離那些差異大的顆粒；操作簡單、方便，但

20、是方便，但是分離效果較差，一般用于粗分。分離效果較差，一般用于粗分。（3 3）離心方法的選擇）離心方法的選擇 差速離心舉例差速離心舉例沉淀：細沉淀：細胞核胞核上清液上清液沉淀：線粒體沉淀：線粒體 溶酶溶酶體體 細胞膜碎片細胞膜碎片 上清液上清液沉淀：沉淀：核糖核蛋白體核糖核蛋白體上清液：上清液：可溶性成分可溶性成分500g,10min500g,10min已經(jīng)破碎的細胞已經(jīng)破碎的細胞10,000g,10min10,000g,10min100,000g,3h100,000g,3h 密度梯度離心：密度梯度離心：用一定的介質在離心管內形用一定的介質在離心管內形成連續(xù)或不連續(xù)的成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，

21、密度梯度，通過重力或離心力通過重力或離心力場的作用，使樣品中的組份依據(jù)其場的作用，使樣品中的組份依據(jù)其沉降速率沉降速率和和密密度的不同度的不同而而分層、分離分層、分離 這類分離又分為：這類分離又分為： 差速差速- -區(qū)帶（區(qū)帶（RateZonalRateZonal，R-ZR-Z） 等密度（等密度（IsopycnicIsopycnic）/ /平衡密度梯度離心平衡密度梯度離心 A. A.差速差速- -區(qū)帶區(qū)帶(R-Z)(R-Z)：是根據(jù)分離的顆粒在梯度是根據(jù)分離的顆粒在梯度液中液中沉降速度的不同沉降速度的不同，在離心力作用下處于不同，在離心力作用下處于不同密度梯度層，從而形成密度梯度層，從而形成一

22、系列區(qū)帶，一系列區(qū)帶，達到彼此分達到彼此分離的目的。離的目的。 方法：方法：在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質（如蔗糖、甘油、（如蔗糖、甘油、CsClCsCl等），待分離的樣品以很等），待分離的樣品以很薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于薄的一層鋪在梯度液的上部，在離心過程中由于不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心不同組份在梯度液中沉降速率的差別，而在離心的的某一時刻某一時刻形成了形成了數(shù)個分別含數(shù)個分別含不同組份顆粒不同組份顆粒的區(qū)的區(qū)帶。帶。 B. B.平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法（equilibrium density equil

23、ibrium density gradient centrifigationgradient centrifigation) )/ /等密度梯度離心法等密度梯度離心法 當欲分離的不同顆粒的當欲分離的不同顆粒的 密度不同時，密度不同時，配制包含其配制包含其 密度范圍的離心介質，在離心力作用下，不同浮力密度范圍的離心介質，在離心力作用下，不同浮力密度的顆粒或沉降、或上浮，只要時間足夠長，就密度的顆粒或沉降、或上浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的浮力密度恰好相等的位置位置（等密度點），等密度點），形成區(qū)帶，從而實現(xiàn)分離目的形成區(qū)帶，從而實現(xiàn)分

24、離目的 常用介質：常用介質：銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等）銫鹽（氯化銫，硫酸銫，溴化銫等） （4 4）注意）注意離心溫度離心溫度和和介質介質pHpH的影響，以免目的的影響，以免目的酶酶凝集、變性和失活凝集、變性和失活，甚至引起轉子和離心機其，甚至引起轉子和離心機其它部件的它部件的腐蝕。腐蝕。 * *一般一般44左右，耐熱酶除外左右，耐熱酶除外 * *必須是酶穩(wěn)定的范圍內，必要時采用緩沖液必須是酶穩(wěn)定的范圍內，必要時采用緩沖液3 3、過濾與膜分離、過濾與膜分離（1 1）透析）透析 透析（透析（dialysis)dialysis)：利：利用用小分子物質的擴散作小分子物質的擴散作用，用，使小分子不

25、斷透過使小分子不斷透過半透膜而半透膜而擴散到膜外，擴散到膜外，而大分子則被截留于膜而大分子則被截留于膜內，內，從而實現(xiàn)分離。從而實現(xiàn)分離。用途：用途：去除酶液中無機鹽、有去除酶液中無機鹽、有機溶劑或低分子量的抑制劑機溶劑或低分子量的抑制劑缺點：缺點：耗時；透析結束后，樣耗時；透析結束后，樣品體積大，濃度低，難于工品體積大，濃度低，難于工業(yè)化生產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn) 透析膜透析膜是帶有微孔的篩是帶有微孔的篩子，其孔徑在一定范圍內子，其孔徑在一定范圍內是可選的；可用動物膜、是可選的；可用動物膜、羊皮紙、火棉膠等制成。羊皮紙、火棉膠等制成。 定義：定義：以膜兩邊的以膜兩邊的流體靜壓差為推動力流體靜壓差為推動力的

26、膜分離技的膜分離技術。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過膜孔，術。在靜壓差作用下，小于孔徑的顆粒穿過膜孔，而大于孔徑者被截留。而大于孔徑者被截留。 超濾膜截留的顆粒直徑為超濾膜截留的顆粒直徑為2-200nm2-200nm，相等于分，相等于分子量子量1x101x103 3-5x10-5x105 5，主要用于，主要用于病毒病毒和和各種生物大分各種生物大分子的分離。子的分離。 壓力一般由壓縮氣體來維持，操作壓力一般控壓力一般由壓縮氣體來維持，操作壓力一般控制在制在0.1-0.7MPa0.1-0.7MPa （2 2）超）超 濾（濾（ultrafiltration)ultrafiltration) 超濾

27、技術的優(yōu)勢：超濾技術的優(yōu)勢：v是純物理過程，是純物理過程，不會改變產(chǎn)品不會改變產(chǎn)品的理化性能和活性的理化性能和活性v與離心和層析法比，與離心和層析法比，處理量大，時間短，易線性處理量大，時間短，易線性放大，成本較低放大，成本較低v收集細胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細胞活性良收集細胞效果優(yōu)良，處理量大，保持細胞活性良好，操作簡單好，操作簡單v可以進行多種工藝的處理，可以進行多種工藝的處理，如：細胞、菌體收集、如：細胞、菌體收集、破碎后的澄清過濾、分離、濃縮、緩沖液更換等破碎后的澄清過濾、分離、濃縮、緩沖液更換等v投資小，通用性強投資小，通用性強超濾技術應用：超濾技術應用：v 濃縮和透析濃縮和透析v

28、 除熱源除熱源v 脫鹽和緩沖液交換脫鹽和緩沖液交換v 小分子處理小分子處理v 細胞收集細胞收集/ /澄清澄清v 病毒收集病毒收集/ /澄清澄清4 4、色譜法（層析法）、色譜法（層析法）（1） 離子交換色譜（層析）離子交換色譜（層析）定義：定義： Ion Exchange Chromatography：以離子交以離子交換劑為換劑為固定相固定相，特定的離子溶液為，特定的離子溶液為流動相流動相，依據(jù)，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同進行分離純化的層析方式。同進行分離純化的層析方式。使用規(guī)模可大可小；純化倍數(shù)為使用規(guī)模可大可小；純化倍數(shù)為101

29、0左右左右離子交換劑分類離子交換劑分類 按其活性基團的不同來分按其活性基團的不同來分 *陽離子交換劑：陽離子交換劑：其活性基團為酸性基團（如磺酸其活性基團為酸性基團（如磺酸基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解基，磷酸基，羧基等），在一定條件下，可以解離出氫離子（離出氫離子（H+)與其它陽離子進行交換，故稱與其它陽離子進行交換，故稱（如：（如： *陰離子交換劑：陰離子交換劑：其活性基團為堿性基團（季胺，其活性基團為堿性基團（季胺，叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出叔胺，仲胺，伯胺等），在一定條件下可解離出OH-與其它陰離子交換。如：與其它陰離子交換。如： 按母體的種類分：按母體的種

30、類分：母體（基質）一般是不溶性聚母體（基質）一般是不溶性聚合物，如樹脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等合物，如樹脂、纖維素、葡聚糖、醇脂糖等 *離子交換離子交換纖維素纖維素: 是纖維素作為母體，交換容量大是纖維素作為母體，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）克干膠）*離子交換離子交換樹脂樹脂: 聚苯乙烯樹脂為母體聚苯乙烯樹脂為母體*離子交換離子交換凝膠凝膠: 葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，交換容量更大交換容量更大2.5-4.5mg/克干膠）克干膠）離子交換層析的基本步驟離子交換層析的基本步驟解吸方法解吸方法-洗脫原理洗脫原理 蛋白質是通過蛋白質是通過靜電引力靜電引力

31、可逆結合在相應的離子可逆結合在相應的離子交換劑上，洗脫蛋白質（即打開蛋白質與離子交交換劑上，洗脫蛋白質（即打開蛋白質與離子交換劑之間的離子鍵）的換劑之間的離子鍵）的常用方法常用方法： 加大反離子的濃度，加大反離子的濃度，常用的反離子是常用的反離子是NaCl 改變溶液的改變溶液的pH （改變結合基團的電荷）（改變結合基團的電荷） 同時同時改變改變pH與與離子強度離子強度分離酶蛋白時交換劑選擇的一般原則：分離酶蛋白時交換劑選擇的一般原則： 根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要：根據(jù)酶穩(wěn)定性的需要： *酶蛋白穩(wěn)定存在的酶蛋白穩(wěn)定存在的pHpI，用陰離子交換劑，用陰離子交換劑 *兩種兩種pH條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換

32、劑條件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可均可 也稱凝膠層析、凝膠過濾或分子排阻也稱凝膠層析、凝膠過濾或分子排阻層析：是指以各種多孔凝膠為層析：是指以各種多孔凝膠為固定相固定相，利用利用流動相流動相中所含有各種組份的中所含有各種組份的相對分相對分子量不同而達到分離子量不同而達到分離的一種層析技術的一種層析技術 2020世紀世紀5050年代末發(fā)展起來的快速簡便的分年代末發(fā)展起來的快速簡便的分離技術離技術操作簡便，不需要再生處理即可反復操作簡便，不需要再生處理即可反復使用，適用于分子量不同的各種物質的分離使用，適用于分子量不同的各種物質的分離（2 2）分子篩層析）分子篩層析l原理：原理： 其其分離是因為

33、不同大小的分子或進入或不進入分離是因為不同大小的分子或進入或不進入凝膠微孔，因而凝膠微孔，因而所經(jīng)過的路程不同所經(jīng)過的路程不同、走過柱全長、走過柱全長所需的時間各異，實現(xiàn)彼此分離的目的：所需的時間各異，實現(xiàn)彼此分離的目的： 能進入微孔的小分子能進入微孔的小分子不斷地進出于一個個凝膠不斷地進出于一個個凝膠顆粒的微孔，做無定向的分子擴散運動（布朗運顆粒的微孔，做無定向的分子擴散運動（布朗運動），因而其向下動），因而其向下移動的速度就很慢移動的速度就很慢； 不能進入微孔的不能進入微孔的大分子大分子則只能分布于凝膠顆粒則只能分布于凝膠顆粒的間隙，隨溶液流動而進行的間隙，隨溶液流動而進行垂直向下的移動，

34、以垂直向下的移動，以較快較快的速度通過凝膠柱。的速度通過凝膠柱。l凝膠材料種類凝膠材料種類 層析用的微孔凝膠是層析用的微孔凝膠是凝膠材料凝膠材料與與交聯(lián)劑交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而交聯(lián)聚合而成的；凝膠內部具有成的；凝膠內部具有微細的、微細的、多孔網(wǎng)狀多孔網(wǎng)狀結構。結構。 * *常用的交聯(lián)劑：常用的交聯(lián)劑：環(huán)氧氯丙烷環(huán)氧氯丙烷 * *常用的凝膠材料：常用的凝膠材料：葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（SephadexGSephadexG） 交聯(lián)丙烯基葡聚糖（交聯(lián)丙烯基葡聚糖（SephacrylSephacryl） 聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel PBio-gel P） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Seph

35、arose) Sepharose) * *新型凝膠材料新型凝膠材料：superosesuperose，superdexsuperdex * *分離性能分離性能：凝膠孔徑大小：凝膠孔徑大小決定決定其能夠分離的顆粒的其能夠分離的顆粒的大大小小；凝膠顆粒越細，流速越慢，；凝膠顆粒越細，流速越慢，分離效果越好分離效果越好。 l相對分子量相對分子量不是唯一的分離依據(jù)；不是唯一的分離依據(jù)； 對于分子量相同的分子，也可依據(jù)其對于分子量相同的分子，也可依據(jù)其分子形狀分子形狀的不同，的不同，再加上各種物質與凝膠之間的再加上各種物質與凝膠之間的非特異性吸附作用的差異，非特異性吸附作用的差異，也可以分離。也可以分離

36、。分子篩層析的優(yōu)缺點分子篩層析的優(yōu)缺點（3）親和色譜）親和色譜(層析）層析） （1）定義：利用生物分子與配基之間所具有的）定義：利用生物分子與配基之間所具有的專一專一而又可逆而又可逆的親和力，分離純化生物分子的技術，是的親和力，分離純化生物分子的技術，是酶分離純化的重要技術酶分離純化的重要技術 專一而可逆的結合包括：專一而可逆的結合包括： 酶蛋白與底物、競爭性抑制物和輔助因子酶蛋白與底物、競爭性抑制物和輔助因子 酶蛋白（抗原）與抗體酶蛋白（抗原）與抗體 酶酶RNA與互補的與互補的RNA （2）原理：）原理： 酶的底物或競爭性抑制劑等通過酶的底物或競爭性抑制劑等通過共價鍵共價鍵與惰性與惰性載體（

37、如瓊脂糖）相連接，形成載體（如瓊脂糖）相連接，形成親和載體親和載體； 當含酶混合物通過親和載體時，靶酶便與底物或當含酶混合物通過親和載體時，靶酶便與底物或競爭性抑制劑發(fā)生特異性結合，競爭性抑制劑發(fā)生特異性結合，保留保留在柱子上，其在柱子上，其它酶和雜蛋白則因它酶和雜蛋白則因“無處可依無處可依”而被洗出柱子而被洗出柱子 最后通過解吸附，將酶洗脫：最后通過解吸附，將酶洗脫： *通過加入底物與通過加入底物與親和載體親和載體競爭競爭酶分子酶分子 *也可也可改變改變pH或離子強度或離子強度使結合的酶使結合的酶解吸解吸（3）特點）特點因其結合的專一因其結合的專一性，所以產(chǎn)品的性，所以產(chǎn)品的純度高純度高步驟

38、少步驟少親和載體的制備親和載體的制備較難較難造價高、規(guī)模小造價高、規(guī)模小四、酶的結晶四、酶的結晶4-1 4-1 定義：定義： 溶質以晶體形式從溶液中溶質以晶體形式從溶液中析出析出的過程，是酶的過程，是酶分離純化的手段之一分離純化的手段之一 時間可以從幾小時，幾天，幾個月，甚至幾時間可以從幾小時，幾天，幾個月，甚至幾年。年。 為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。為獲得較高純度的酶創(chuàng)造了條件。 為酶結構和功能的研究提供了適宜的樣品；為酶結構和功能的研究提供了適宜的樣品； Art or science？1 1、鹽析結晶法：、鹽析結晶法： 在適當?shù)臏囟群驮谶m當?shù)臏囟群蚿HpH條件下，于接近飽和的酶條件下，于

39、接近飽和的酶液中液中緩慢增加緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達到慢慢降低，達到稍微過飽和狀態(tài)稍微過飽和狀態(tài)，而析出酶晶體，而析出酶晶體的過程的過程; ; 多用硫酸銨，也用硫酸鈉等多用硫酸銨，也用硫酸鈉等4-2 4-2 結晶方法結晶方法 通過汽相擴散的方式增加鹽濃度，使蛋白析出結晶。使用的試劑盒為商品化的Hampton Research Crystal Screen I&II和PEG Screen篩選試劑盒進行，分別采用懸滴法和坐滴法。SP0987SP0987、SPD0280SPD0280蛋白質的結晶蛋白質的結晶SP0987在0.2M檸檬酸鋰

40、、20%PEG3350條件晶體質量較好SPD0280在0.2M硫酸鎂、20%PEG3350條件下晶體質量較好 圖圖3 SPD0280蛋白質母體晶體蛋白質母體晶體 圖圖4 SPD0280蛋白質硒代晶體蛋白質硒代晶體 圖圖1 SP0987蛋白質母體晶體蛋白質母體晶體 圖圖2 SP0987蛋白質硒代晶體蛋白質硒代晶體 2 2、有機溶劑結晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢、有機溶劑結晶法：是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機溶劑，使酶的加入某種有機溶劑，使酶的溶解度降低溶解度降低而而析出析出酶酶晶體的過程；常用的有機溶劑有乙醇、丙醇、甲晶體的過程；常用的有機溶劑有乙醇、丙醇、甲醇等醇等3 3、透析平衡結晶

41、法：將酶液裝進透析袋，對一定、透析平衡結晶法：將酶液裝進透析袋，對一定濃度的鹽溶液進行透析，使?jié)舛鹊柠}溶液進行透析，使酶液逐漸達到飽和態(tài)酶液逐漸達到飽和態(tài)而而析出結晶析出結晶的過程的過程4 4、等電點結晶法：是通過緩慢改變酶液的、等電點結晶法：是通過緩慢改變酶液的pHpH，使，使之逐漸之逐漸達到其等電點達到其等電點，而使，而使酶析出結晶酶析出結晶的過程的過程 五、酶的濃縮與干燥五、酶的濃縮與干燥 濃縮（濃縮（concentration)concentration)與干與干燥（燥（Drying)Drying)都是都是酶酶與與溶劑溶劑（通（通常是水）常是水）分離的技術過程，是酶分離的技術過程，是酶

42、分離純化的一個重要環(huán)節(jié)分離純化的一個重要環(huán)節(jié)1 1、濃縮、濃縮：是從低濃度溶液中：是從低濃度溶液中除去除去水分水分或或其它溶劑其它溶劑而成為而成為高濃度溶高濃度溶液液的過程的過程 蒸發(fā)濃縮，即通過蒸發(fā)濃縮，即通過加熱加熱或或減減壓壓方法使溶液中的部分溶劑方法使溶液中的部分溶劑汽化汽化蒸發(fā)，得以濃縮：蒸發(fā)，得以濃縮： 真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器真空蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器薄膜蒸發(fā)器2 2、干燥：、干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它溶劑除去一部分，獲得含水較少的溶劑除去一部分，獲得含水較少的固體物質固體物質的過程的過程 干燥時，首先是

43、從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內部干燥時，首先是從其表面蒸發(fā)，隨后才是其內部的水分子擴散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。的水分子擴散到表面繼續(xù)蒸發(fā)。 干燥后的物質穩(wěn)定性好，利于干燥后的物質穩(wěn)定性好，利于保存、運輸和使用保存、運輸和使用 常用的方法：常用的方法：真空干燥真空干燥 冷凍干燥冷凍干燥 噴霧干燥噴霧干燥 氣流干燥氣流干燥 吸附干燥等吸附干燥等 獲得的酶質量最高的是獲得的酶質量最高的是冷凍干燥冷凍干燥3 3、酶的保存、酶的保存 在合適的條件下，酶一般可保存較長的時間。在合適的條件下，酶一般可保存較長的時間。 在在44下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或下，可將酶懸浮在濃硫酸銨或PEGPEG溶液中溶液中保存，保存，10

44、mg/ml10 mg/ml的濃酶液可加入的濃酶液可加入25%25%50%50%甘油保存甘油保存 可將酶液可將酶液過濾除菌過濾除菌，以減少微生物降解作用，以減少微生物降解作用 需需還原性巰基還原性巰基維持催化活性的酶，可與維持催化活性的酶，可與1mmol.L1mmol.L- -1 1EDTAEDTA和還原性巰基試劑一起在液氮中保存和還原性巰基試劑一起在液氮中保存 許多酶在許多酶在冰凍狀態(tài)冰凍狀態(tài)下保存得很好下保存得很好1 1、防止酶變性失活：、防止酶變性失活：（1 1）低溫）低溫 （2 2）一般在中性）一般在中性pHpH環(huán)境操作（環(huán)境操作（pH4pH1010不穩(wěn)定）不穩(wěn)定）（3 3）防重金屬）防

45、重金屬, ,有機溶劑有機溶劑, ,微生物及蛋白酶污染微生物及蛋白酶污染2 2、追蹤酶分離每一步的、追蹤酶分離每一步的總活力總活力和和比活力比活力，評判每，評判每個步驟的可行性。個步驟的可行性。6-1 6-1 酶分離純化的基本原則酶分離純化的基本原則六、酶純化步驟的設計及評價六、酶純化步驟的設計及評價6-2 6-2 選擇純化方法時注意事項選擇純化方法時注意事項1 1、樣品體積、酶和雜質的量、樣品體積、酶和雜質的量、pHpH及離子強度及離子強度2 2、酶的物理化學性質：、酶的物理化學性質： 大小、等電點、溶解度、親水性大小、等電點、溶解度、親水性3 3、需要純化的酶的生物學性質：、需要純化的酶的生

46、物學性質： 穩(wěn)定性、輔助因子穩(wěn)定性、輔助因子6-3 6-3 分離方法的順序選擇分離方法的順序選擇v樣品量由大到小樣品量由大到小v分辨率由低到高分辨率由低到高v酶的回收率由低到高酶的回收率由低到高預處理預處理-粗分粗分-細分細分-酶的制品酶的制品粗分：初步純化粗分：初步純化細分細分1細分細分2檢查純化的進展情況檢查純化的進展情況有機溶劑、硫酸銨沉淀、有機溶劑、硫酸銨沉淀、磷酸鈣分級吸附、超濾磷酸鈣分級吸附、超濾等等離子交換層析、凝膠過離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、聚濾層析、親和層析、聚焦層析等焦層析等SDS-PAGE電泳、等電聚焦電泳、等電聚焦6-4 6-4 純化步驟的定量評價純化步驟的

47、定量評價測定試樣中酶的活力測定試樣中酶的活力和蛋白質濃度和蛋白質濃度計算比活力計算比活力制作純化表制作純化表酶單位酶單位/mg/mg蛋白質蛋白質酶活性及比活性測定酶活性及比活性測定酶的活性酶的活性酶的活性單位酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應在單位時間（在規(guī)定條件下，酶促反應在單位時間（s s、minmin或或h h）內生成一定量（）內生成一定量（mgmg、gg、molmol等）的產(chǎn)物等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。酶活性測定的酶活性測定的國際單位國際單位(IU)(IU)在特定的條件下，每分鐘催化在特定的條件下，每分鐘催化1 1molmol底物底物轉化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位。轉化為產(chǎn)物所需的酶量為