1、第25章 病毒及其疫苗的生產制備技術第一節 病毒的生產制備病毒需在活的敏感細胞中才能增殖，在細胞培養技術不成熟之前，人們為研究病毒，往往采用雞胚接種或動物接種的方法來別離、鑒定病毒或制備一定量的病毒液，但這種方法因個體和種屬差異，不僅許多病毒難以找到適宜的敏感動物，而且即使在敏感動物中繁殖，往往個體差異大而影響結果的判定，隨著細胞培養技術的開展，首先在病毒學研究方面獲得了廣泛的應用，為病毒的繁殖、鑒定提供了來自不同動物包括人、不同組織的細胞來源，通過敏感性篩選，目前絕大多數病毒均可有相應的敏感細胞，為病毒的別離、鑒定和增殖創造了條件。同時也為病毒的大量生產提供了細胞來源，隨著細胞大量生產技術的

2、開展，因此對病毒來說只要有敏感的細胞，就可以進行大規模生產。一、病毒生產的目的和用途1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或外表抗原疫苗，或用病毒抗原制備免疫血清抗體。2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預防接種。3、為了生產基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療及基因疫苗的預防接種。4、為了制備干擾素的病毒誘生劑NDV、仙臺病毒等，用于干擾素的生產。5、生物戰用的病毒生物戰劑。常選用毒力強、抵抗力強、對不同國家人群最敏感的病毒，又能通過氣溶膠或昆蟲和污染的水土進行傳播的病毒。這是戰爭狂們正在開展的研究，應警惕。二、病毒生產制備的方法1、動物

3、接種，如狂犬病毒、腦炎蟲媒病毒采用鼠、兔腦內接種后收取腦組織制成懸液。2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒NDV-F、仙臺病毒等，目前尚無敏感細胞，常采用910日胚齡的尿囊腔接種，37孵育72小時收獲尿液，用雞紅血球測定血凝效價。Q熱用7日齡鴨胚進行卵黃囊接種收獲卵黃囊，馬腦炎病毒常采用10日齡雞胚體接種，收獲全胚體液等。3、細胞培養法詳見第二篇第18章不同的病毒選用相應的敏感細胞，采用轉瓶培養、多層培養、微載體培養或懸浮攪拌培養等方法,先大量增殖細胞，然后接種一定量的病毒,繼續培養適當時間時，凍融細胞后，離心收獲上清。以上病毒大量生產后可制作病毒疫苗死疫苗或減毒活疫苗，也可用來作干擾素

4、誘生劑或提取病毒外表抗原成分，但反對用作生物戰劑，危害人類健康和生命。第二節 病毒疫苗的生產制備病毒疫苗的生產制備與病毒的生產制備根本相同，目前進行人工主動免疫，用于病毒病預防的疫苗有滅活疫苗Killed Vaccine,又稱死疫苗，減毒活疫苗Live Vaccine,亞單位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的減毒活疫苗，基因工程亞單位疫苗，重組牛痘多價疫苗。一、病毒疫苗的種類(一)滅活疫苗：目前常用的有流行性乙型腦炎疫苗，狂犬病疫苗二倍體細胞與地鼠腎細胞可用于生產狂犬病病毒固定毒滅活疫苗，流感滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，以滅活病毒核酸而不影響其抗原性。(二)減毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通過動物

5、傳代或細胞傳代篩選對人毒力低的變異株病毒。常用的有脊髓灰質炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯合疫苗如麻疹、腮腺炎、風疹聯合疫苗。(三)亞單位疫苗：用化學試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以此制成的疫苗稱亞單位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神經氨酸酶亞單位疫苗。(四)多肽疫苗：采用乙肝攜帶者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制備的HBsAg基因表達產物制備的疫苗。(五)基因缺失的減毒活疫苗：在病毒的基因組中，使其有毒力的相關基因發生缺失而制成的減毒活疫苗稱基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶

6、TK缺失株第一代和gp3區缺失株第二代，單純皰疹病毒的22基因缺失株，目前有待進一步研究。(六)基因工程亞單位疫苗：將病毒外表抗原基因，通過基因重組，在酵母或CHO細胞中進行表達亞單位多肽抗原成分而制成的疫苗，稱基因工程亞單位疫苗，如乙型肝炎病毒的外表抗原HBsAg的基因在酵母和CHO細胞中表達而提取獲得的純品HBsAg多肽。即將上市。(七)重組牛痘多價活疫苗。以牛痘苗為載體來表達數十種外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，經基因重組后而制成的牛痘苗病毒，經一次劃痕接種可使機體同時能獲得對多種病毒的免疫力，大大減少了接種次數。此外腺病

7、毒和脊髓灰質炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組后的活疫苗，經口服后可同時獲得兩種病毒的免疫力，有待于進一步研究、開發。上述病毒疫苗有的是采用細胞培養技術和細胞工程來進行生產制備的，現將采用細胞工程制備病毒疫苗種類和敏感細胞以及生產方式規于下表。二、細胞培養法制備的常用疫苗如表25-1。表25-1 采用細胞培養法生產的常用病毒疫苗疫 苗制備疫苗的 細 胞培養方法名 稱活/死(疫苗株)脊 髓 灰滅活Salk株猴腎細胞原代/2-3代轉瓶培養質炎疫苗活Sabin株Vero細胞微載體培養腮 腺 炎活ME株幼地鼠、狗腎轉瓶培養疫 苗豚鼠腎細胞羅氏瓶培養麻疹活疫苗 Edomonste、 L1

8、6、滬191、 Moraten、 Schwar2株原代雞胚纖維母細胞，人二倍體人羊膜、狗腎、羊腎豚鼠腎細胞羅氏瓶培養轉瓶培養單純瘡疹死72株兔腎、豚鼠腎羅氏瓶培養病毒疫苗豚鼠胚成纖維細胞轉瓶培養巨細胞病毒疫苗活Towne株WI-38人胚肺細胞轉瓶培養狂犬病毒疫苗死AV01/AV02株 CUS株人二倍體細胞微載體培養流行性乙型腦炎疫苗滅活5-3株人二倍體細胞多層滋養增殖器森林腦炎病毒疫苗滅活雞胚纖維母細胞幼地鼠腎細胞轉瓶培養三、用細胞培養制備病毒疫苗的優點：病毒疫苗的制備開始多用動物臟器、禽類胚胎第一代疫苗。然而因來源困難，很不經濟，制作麻煩，數量受限，更危險的是這些組織中間可能含有潛在致癌病毒

9、和慢性病毒，后改用原代細胞來制作疫苗第二代疫苗，如麻疹疫苗、乙腦疫苗等，隨著細胞培養的開展，特別是自70年代后我國二倍體細胞株相繼建立，為疫苗生產創造了極為有利的根底，這比用原代細胞制備疫苗更優越。如：1在細胞傳代期間可進行比擬全面的檢查，特別是對潛在病毒和致癌性的檢查，確保平安。2可使逐漸適應于無血清或無蛋白培基中生產繁殖，以排除過敏因素。3可挑選對病毒敏感的細胞克隆。以利病毒在細胞中大量增殖，有助于疫苗產量的提高。4易于大量生產和進行連續自動化工業生產，以滿足量的需求。國外已建立的二倍體細胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，國內已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生產，

10、如麻疹活疫苗、乙型腦炎疫苗、脊髓灰質炎疫苗、腮腺炎疫苗等，從目前開展來看，用二倍體細胞制備疫苗將有取代其他原代細胞和傳代細胞的趨勢，但目前仍有一些病毒疫苗的制備還需用原代細胞，近年來有人主張用腫瘤細胞制備人用滅活疫苗。四、提高疫苗的效力常采用的方法：1細胞的藥物處理：用某些藥物處理細胞后可以刺激病毒繁殖如下表，其方法為：在細胞形成單層后，用一些化學藥物來處理，然后洗去，再接種病毒，就可使病毒提前成熟，產量高，現列表如下：處理細胞的藥物刺激的病毒5-碘-2-脫氧尿核甙風疹、腺病毒、巨細胞病SV-40維生素A或Tween-80脊髓灰質炎病毒、濾泡性口腔炎病毒膽固醇或卵磷質脊髓灰質炎病毒DEAE-d

11、extran脊髓灰質炎病毒、風疹痘類病毒，付流感病毒胰 酶痘類病毒、呼吸道腸道病毒，流感病毒、鼻病毒二甲亞砜脊髓灰質炎病毒、流感、皰疹病毒放線菌素D麻疹、脊髓灰質炎病毒、付流感病毒2在維持液中補充某些物質也有利于某些病毒的復制、列表如下：增 加 的 藥 物刺 激 的 病 毒Tween-80或油酸鈉乙型腦炎谷氨酰胺麻疹、脊髓灰質炎病毒、仙臺病毒精氨酸痘類病毒、皰疹病毒脯氨酸、賴氨酸乙型腦炎3毒種的選擇：經過空斑挑選產量高的大空斑毒株，精制毒種可提高病毒產量。4病毒液的濃縮：經濃縮后，病毒濃度增高，從而效價也隨之上升。五、影響疫苗質量的因素：1毒種：毒種的優劣不僅影響疫苗的產量，而且也影響疫苗的質

12、量，毒種不純會產生相互干擾，減毒活疫苗毒種假設毒力上升易造成事故，因此毒種的選擇應挑選那些致病性低，免疫效價高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產，可在傳代細胞上傳代的毒種。2培養病毒的細胞：細胞假設有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不能用作疫苗生產。對此因素應嚴格檢查。此外假設細胞本身發生轉化后，不宜于制備活疫苗，只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。3培養液：培養細胞的營養液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會出現某種程度的過敏反響，為此，應盡量使細胞適應于無血清蛋白的培養基中，以消除過敏源。4甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來制備滅活病毒疫

13、苗，但要控制含量。病毒被滅活的程度與滅活的溫度和甲醛的濃度等因素有密切關系。一般用熱滅活的方法，采用在37滅活一定時間。經熱滅活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和穩定性不受影響，而且滅活病毒的溫度提高以后，滅活時間相對可以縮短，滅活劑的用量也可以減少。甲醛能刺激局部而引起疼痛和紅腫，并有釋放組織胺的作用。因此制備疫苗時減少甲醛濃度是必要的。如果疫苗內游離甲醛含量降低到一定程度后，可考慮不需再用亞硫酸氫鈉來中和甲醛。這對減少注射后疼痛及便于推廣預防接種有重要意義。六、生產病毒和制備病毒疫苗的常用方法(一)制備工藝流程1脊髓灰質炎病毒活疫苗制備工藝猴 腎 細 胞 培 養接種病毒測0%正常細胞對照收獲

14、病毒，合并，加MgCl2無菌試驗猴病毒檢查獲腎細胞SV40B病毒檢查兔腎細胞病毒效價滴定合并，過濾加MgCl2無菌試驗分亞批柯薩奇病毒檢查乳鼠病毒滴定型特異性檢查B病毒復檢家兔T特征試驗分裝病毒滴定猴體剩余致麻痹力試驗平安試驗病理切片結核桿菌檢查分裝無菌試驗病毒滴定保存于-20待檢定合格后加 工 糖 丸脊髓灰質炎活疫菌工藝流程2、流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝 地 鼠 腎 剪碎，胰酶消化 地鼠腎細胞懸液 37,3天 細胞培養液，pH7.0pH7.2 單層細胞 洗滌細胞，去除牛血清 10-410-5濃度病毒感染細胞 3234培養23天 收獲病毒液收二次 按1:2000參加甲醛 22，8天 滅活

15、病毒液 合并，平安及效力試驗 原液 參加亞硫酸氨鈉 半成品 分裝 成品 檢定(包括理化性質，無菌試驗、平安試驗， 防腐劑、試劑及剩余牛血清含量等 合格成品(二)生產方法：病毒和病毒疫苗的生產方法根本相同，其規模取決于細胞生產規模，因此上述介紹的細胞大量生產的方法和工藝均可用來生產病毒和病毒疫苗，可根據需要及適宜生產條件來選用培養裝置，如轉瓶培養，因設備簡單，便于生產單位采用。而多層培養，微載體培養，目前國外已用于生產，我國仍在研究中。懸浮攪拌培養的簡易裝置已應用于疫苗生產，全自動懸浮發酵罐，在干擾素生產中有應用，但在疫苗生產中正在試用，下面著重介紹微載體培養法生產病毒的技術。1、微載體懸浮培養

16、細胞的病毒生產工藝作者選VSV病毒來接種經微載體培養的敏感細胞，病毒的效價測定用A549細胞也可用Wish或Hep-2細胞或雞胚纖維母細胞測TCID50，病毒的效價為6 Log TCID50/mL，用雞胚細胞空斑法測定一般為107Pfu/mL。VSV在方瓶貼壁細胞中的增殖100mL方瓶，10mL培養基待BHK21、BHK13、CHO-K1細胞長滿單層，棄上清參加10-2VSV病毒懸液0.2ml，37吸附1小時，加病毒維持液培養20小時，于-30凍存，待測效價。VSV在微載體懸液培養的細胞中增殖。 微載體培養的BHK21或BHK13、或CHO-K1細胞， 34天后細胞密度已達1106細胞/mL

17、靜置30分鐘 盡量吸去原培養基 37 將10-2VSV病毒按50mL培養體積參加1mL病毒液于微載體細胞中 37 50r/min攪拌5分鐘 靜置吸附1小時每20分鐘攪拌2分鐘 參加病毒維持液至原體積 37繼續攪拌培養20小時 于-30凍融后 2000 r/min 低溫離心10分鐘 收集上清，即為VSV增殖的病毒液，分裝凍存，待測效價結果，在微載體懸浮培養的三株細胞所繁殖VSV病毒不僅產量大，而且病毒效價平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效價最高，平均可達7.75logTCID50比原先的毒種效價還要高1.75LogTCID50，又起到了提高病毒效價的作用。此方法也可應用于生產病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感細胞能在微載體上大量生產。假設疫苗株是減毒活疫苗株，此法生產的病毒可直接制備活疫苗。假設疫苗株為非減毒活疫苗株，此法生產的病毒可用甲醛滅活法制備死疫苗。2、轉瓶培養法此法是目前各大生物制品研究所常用于生產疫毒疫苗的方法，如生產脊髓灰質炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。將細胞制備成懸液后，在溫室內37使支架以812轉/小時緩慢轉動，以使細胞貼壁，當