1、第二章第二章 光學顯微技術光學顯微技術 第二章第二章 光學顯微技術光學顯微技術l光學顯微鏡的發展歷程光學顯微鏡的發展歷程l光學顯微鏡的成象原理光學顯微鏡的成象原理l光學顯微鏡的構造和光路圖光學顯微鏡的構造和光路圖l顯微鏡的重要光學參數顯微鏡的重要光學參數l樣品制備樣品制備1. 1. 光學顯微鏡的發展歷程光學顯微鏡的發展歷程l1590年，荷蘭的詹森父子(Hans and zachrias Janssen) 制造出第一臺原始的、放大倍數約為20倍的顯微鏡。l16l0年，意大利物理學家伽利略(Galileo)制造了具有物鏡、目鏡及鏡筒的復式顯微鏡。 l1665年，英國物理學家羅伯特胡克(Robert

2、 Hooke)用左圖這臺復式顯微鏡觀察軟木塞時發現了小的蜂房狀結構，稱為“細胞”，由此引起了細胞研究的熱潮。l 1684年，荷蘭物理學家惠更斯(Huygens)設計并制造出雙透鏡目鏡惠更斯目鏡，是現代多種目鏡的原型。這時的光學顯微鏡已初具現代顯微鏡的基本結構(右圖)。（左）1665年 R. Hoock用來發現細胞的光學顯微鏡，(右)1848年的顯微鏡。1. 1. 光學顯微鏡的發展歷程光學顯微鏡的發展歷程l在顯微鏡的發展史中，貢獻最為卓著的是德國的物理學家、數學家和光學大師恩斯特阿貝(Ernst Abbe)。l他提出了顯微鏡的完善理論，闡明了成像原理、數值孔徑等問題，在1870年發表了有關放大理

3、論的重要文章。l兩年后又發明了油浸物鏡，并在光學玻璃、顯微鏡的設計和改進等方向取得了光輝的業績。2. 光學顯微鏡的成象原理光學顯微鏡的成象原理l2.1 衍射的形成衍射的形成l2.2 阿貝成像原理阿貝成像原理2.1 2.1 衍射的形成衍射的形成l物理光學把光視為一種電磁波，具有波粒二象性，即波動性和粒子性。由于光具有波動性質，使得光波相互之間發生干涉作用，產生衍射現象。狹縫實驗l屏幕上的P1點到狹峰上邊緣的距離和它到狹峰下邊緣的距離之差為一個波長。l從狹峰上緣和從狹峰下緣發出的兩列光波在P1點相互增強，但這兩列光波不過是從連線b上發出的無數光波中的一對，其他任意兩列光波到達P1點的波程差均小于一

4、個波長。l整個狹峰內發出的光波的累計相干效果，是在P1點兩側造成一個光強的低谷，P1點位于谷底位置。l相反，在P2點處，從狹縫上緣和下緣發出的光波的波程差1 個波長，P2成為相干增強區的中心，稱為第一級衍射極大值。衍射結果衍射結果點光源通過透鏡產生的埃利斑第一暗環半徑 式中 n為介質折射率，照明光波長，透鏡孔徑半角，M透鏡放大倍數說明埃利斑半徑與照明光源波長成正比，與透鏡數值孔徑成反比 sin61. 00nMR 由斑點光源衍射形成的埃利斑（a）及其光強分布圖（b）衍射使物體上的一個點在成像的時候不會是一個點，而是一個衍射光斑。如果兩個衍射光斑靠得太近，它們將無法被區分開來。2.2 2.2 阿貝

5、成像原理阿貝成像原理l對于周期性結構的物體，圖像的形成用阿貝成像原理來解釋。l光線通過細小的網孔時要發生衍射，衍射光線向各個方向傳播，凡是光程差滿足 k=0，1，2，的，互相加強。同一方向的衍射光則成為平行光束。l平行光束通過物鏡在后焦面上會聚；形成衍射花樣。衍射花樣上的某個衍射斑點是由不同物點的同級衍射光相干加強形成的；同一物點上的光由于衍射分解，對許多衍射斑點有貢獻。l從同一物點發出的各級衍射光，在產生相應的衍射斑點后繼續傳播，在象平面上又相互干涉，形成物象k阿貝成像原理l阿貝成像原理可以簡單地描述為兩次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物體的散射作用形成衍射譜，各級衍射波通過干涉重新在像

6、平面上形成反映物的特征的像。物與象之間的相似性 l物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不讓衍射光通過就不能成象，參與成象的衍射斑點愈多，則物象與物體的相似性愈好。3. 3. 光學顯微鏡的構造和光路圖光學顯微鏡的構造和光路圖4 4 顯微鏡的重要參數顯微鏡的重要參數l4.1 數值孔徑數值孔徑l4.2 分辨率分辨率l4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l4.4 光學透鏡的象差光學透鏡的象差4.1 4.1 數值孔徑數值孔徑l數值孔徑（NA）是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（n）和半孔徑角（）的正弦之乘積。NA= nsinl孔徑角是物鏡光軸上的物點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑

7、角越大，進入物鏡的光通亮就越大，分辨率越高。孔徑角與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。l 根據阿貝成像原理，衍射光線反映了物體形貌的細節，因此一個物鏡要反映物體的細節，必須能夠接受盡量多的高階衍射光線。 l物鏡接收衍射光線的能力也強烈的依賴于在樣品與鏡頭之間的介質。因此，數值孔徑的概念更加能夠有效的描述物鏡的成像能力。 4.2 4.2 分辨率分辨率瑞利判據：兩埃利斑中心間距等于第一暗環半徑R。此時, 兩中央峰之間疊加強度比中央峰最大強度低19，因此肉眼仍能分辨是兩個物點的像 分辨本領l此時, 樣品上相應的兩個物點間距離r。定義為透鏡能分辨的最小距離，也就是透鏡的分辨本領。lr。 R。

8、Ml分辨本領是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定，NA值越大，照明光線波長越短，分辨率就越高。 sin61. 00nr 4.3 4.3 放大率和有效放大率放大率和有效放大率l由于經過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應該是物鏡放大率和目鏡放大率1的乘積： =1l顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。l當選用的物鏡數值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節不清的圖像，稱為無效放大倍率。4.4 4.4 光學透鏡的象差光學透鏡的象差l（1 ）球面象差（簡稱球差）邊緣與中心部分的折射光不能通過會聚相交于一點

9、光學透鏡的象差光學透鏡的象差l（2）色象差 由于組成白光的各色光波長不同，折射率不同，因而成象的位置也不同 光學透鏡的象差光學透鏡的象差l（3）象域彎曲。 垂直于光軸的直立的物體經過透鏡后臺形成一彎曲的象面，稱為象域彎曲 象域彎曲是幾種象差綜合作用的結果 5 5樣品制備樣品制備l5.1取樣取樣l5.2 鑲樣鑲樣l5.3 磨光磨光l5.4 拋光拋光l5.5腐蝕腐蝕5.15.1取樣取樣l取樣應選擇有代表性的部位l對于軟材料，可以用鋸、車、刨等加工方法；l對于硬材料，可以用砂輪切片機切割或電火花切割等方法；l對于硬而脆的材料，如白口鑄鐵，可以用錘擊方法；l在大工件上取樣，可用氧氣切割等方法。 5.2

10、 5.2 鑲樣鑲樣l用專門的鑲樣機，在合適的加熱溫度和壓力下，將試樣鑲嵌在固化的樹脂或塑料基體中。l還可以采用機械鑲嵌法，即用夾具夾持試樣。5.3 5.3 磨光磨光l金相試樣的磨光除了要使表面光滑平整外，更重要的是應盡可能減少表層損傷。l每一道磨光工序必須除去前一道工序造成的變形層，而不是僅僅把前一道工序的磨痕除去。l手工磨光時，本道工序的磨痕應與上一道工序的磨痕方向垂直，這樣可以使試樣磨面保持平整并平行于原來的磨面。5.4 5.4 拋光拋光（1）機械拋光。粗拋，精拋。（2）電解拋光。電解拋光時，在試樣表面上形成一層具有較高電阻的薄膜，試樣凸起部分的膜比凹下部分薄，膜越薄電阻越小，金屬溶解速度越快，從而使凸起部分漸趨平坦。（3）化學拋光?；瘜W拋光的原理與電解拋光類似，是化學藥劑對試樣表面不均勻溶解的結果。 5.55.5腐蝕腐蝕（1）化學腐蝕。l純金屬及單相合金的腐蝕是一個化學溶解的過程。由于晶界上原子排列不規則，具有較高的自由能，所以晶界易受腐