1、載體構(gòu)建目的基因克隆引物設(shè)計PCR質(zhì)粒（載體）提取質(zhì)粒選擇提取步驟質(zhì)粒與目的基因雙酶切選擇內(nèi)切酶摸索酶切條件（時 間和溫度）電泳檢測及回收純 化步驟載體與目的基因連接一、原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基 因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí) 現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。二、操作步驟1、搖菌（制作感受態(tài)細(xì)胞備用）取裝有液體培養(yǎng)基的 3ml試管兩支（依情況而定），每管加 40-100卩I菌種，過夜搖。2、提質(zhì)粒（也就是載體）依照提質(zhì)粒試劑盒中的說明書操作（根據(jù)情況最后一步洗脫時可以多洗1-2次）。3、酶切（雙酶切產(chǎn)生

2、粘性末端）反應(yīng)所需試劑體積（單位：ul ）質(zhì)粒10所需內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液2所需限制性內(nèi)切核酸酶1HzO7將加好的EP管置于37C保溫1-2h。（依照提酶切的具體步驟操作；為了達(dá)到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度）4、電泳檢測將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切是否成功?；厥漳z：瓊脂糖與緩沖液一比一制膠，經(jīng)過切膠回收目的產(chǎn)物，也有目的產(chǎn)物純化的功能； 檢測膠：瓊脂糖與緩沖液一比二制膠，為了檢測目的條帶與預(yù)期是否相符。切膠回收與產(chǎn)物純化是差不多的過程，所達(dá)到的目的是一樣的：切膠回收也是一種純化過程，它能去除非目的片段，然后用回收試劑盒進(jìn)行純化，能將很不純的DNA溶液純化；產(chǎn)物

3、純化是將較純的 DNA溶液進(jìn)一步除去多余的雜質(zhì)，用純化試劑盒，你會發(fā)現(xiàn)純化試劑盒和回 收試劑盒的步驟幾乎一樣。5、載體與目的基因連接如果電泳檢測酶切成功的話，則仔細(xì)將所需的片段切割下來，將膠體回收（依照膠回收試劑盒說明書操作）；之后將回收的片段和載體連接。置于溫箱，12-16 C,保溫8-16h6、轉(zhuǎn)化（連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中）依照轉(zhuǎn)化具體操作步驟做感受態(tài)，將上述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，涂板培養(yǎng)，37C,12-16h。7、單克隆檢測（1 ）挑單克隆先將AMP從冰箱中取出，待融化后，在3ml裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中加入 3卩L的AMP用槍頭混勻；取1.5 mlEP管5支（依情況可以多挑幾管）

4、，給每支管中加500卩L上述 培養(yǎng)液，然后用接種環(huán)（或黃槍頭）挑單克隆，挑完后用槍吹打；之后，將挑好的菌搖4-5小時，至混濁即可。（2）單克隆檢測以每管搖好的菌液為模板，以原有的引物進(jìn)行PCR然后將PCR產(chǎn)物跑電泳，觀察電泳圖像中那幾管的條帶正確，將正確條帶相對應(yīng)管的菌液再抽取100卩L,加到3ml （有LB液體培養(yǎng)液，AMP）試管中，過夜搖；第二天重?fù)u，將搖好的菌取 1ml于1.5mlEP管中送測序，并 保種。注：挑單克隆時，一定要挑單一圓潤的菌落，有衛(wèi)星斑的不挑。 別忘記往培養(yǎng)基中加 AMP 用接種環(huán)挑菌后，要在酒精燈上反復(fù)灼燒，然后再進(jìn)行下一次挑菌。三、注意事項(xiàng)1. 連接產(chǎn)物可短時間在-20 C保存，使用時可以取出進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；2. 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，冰浴和熱激要嚴(yán)格控制好時間；3. 連接反應(yīng)是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟，其成敗的重要參數(shù)之一就是溫度，因此要控 制好連接溫度。4進(jìn)行黏末端連接時，會產(chǎn)生一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化菌中過高的假陽性克隆背景。針對這一問題，常采用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）去掉載體的5&